番茄碱对体外人食管癌Eca-109细胞增殖、凋亡的影响及机制*

万泽浩, 王丁悦, 芦梓楠, 冯修来, 米日亚·买明， 依力夏提·马木提， 吕红博

新疆医科大学第一附属医院 1小儿心胸外科， 4超声科(新疆乌鲁木齐 830054)； 2中国医科大学第一附属医院超声科(辽宁沈阳 110001)； 新疆医科大学附属肿瘤医院 3肿瘤防治研究所， 5影像中心， 6胸外科(新疆乌鲁木齐 830011)

食管癌是一种常见恶性癌症，尤其在我国北方各省发病率和病死率位于世界前列。在世界高发地域，食管癌以鳞癌为主，中晚期食管癌治疗药物很少，且没有明确效应的靶向药物。时至今日，一方面传统外科手术辅以放疗、化疗的治疗方式更新迭代，另一方面新兴的治疗手段，如生物治疗、光动力治疗等不断兴起，但以总体生存率的结局评判，大多数实体恶性肿瘤的治疗效果不尽如人意[1]。随着对原癌基因、抑癌基因及其产物的现代分子生物学的深入研究，新分子靶向药物已经成为了中晚期食管癌患者的曙光。一种是肿瘤血管内皮生长因子抑制剂，可以抑制血管的生成[2-3]；另一种是诱导肿瘤细胞凋亡剂促进肿瘤细胞凋亡，此类药物常影响在食管癌[4]、白血病[5]、结肠癌[6]、乳腺癌[7]、宫颈癌[8]等都有连续高表达的核因子-κB(NF-κB)从而干扰相关通路。番茄碱是从番茄叶茎中提取的一种糖苷类生物碱[9]，具有抑制血管增生和抗癌的效果[10-12]。2019年6月至2020年10月，本实验观察番茄碱对食管癌Eca-109细胞增殖及凋亡过程的影响，探究番茄碱抗肿瘤机制，并以期指导新的食管癌临床治疗思路和方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 经过实验室检测无支原体、衣原体和其他微生物感染购自武汉博士德公司的食管癌Eca-109细胞。本研究经新疆医科大学伦理委员会审核，给予免除涉及人的生物医学伦理审查。

1.1.2 主要实验试剂 番茄碱购自同田生物公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自 Hyclone公司； CCK-8试剂盒购自Dojindo公司；Annexin V-FITC/PI 试剂盒购自 BD公司;BCA定量试剂盒、蛋白质提取盒购自南京凯基公司(中国)；NF-κBp65、血管内皮生长因子(VEGF)、GAPDH购自CST公司；蛋白质Marker购自Life公司。

1.1.3 主要仪器 超净工作台、全波长酶标仪购自美国Thermo公司。流式细胞仪购自美国BD公司；PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人食管癌Eca-109放进含10%胎牛血清的培养液的培养皿，培养皿平放在37℃、5% CO2培养箱中。经过培养3 d后，将培养皿放置于倒置镜下观察，选取细胞密度达到90%左右的培养皿，用PBS缓冲液冲洗3次，再用胰酶-EDTA(含酚红)消化传代。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 将对数生长期的食管癌Eca-109加入配制番茄碱浓度1、2、3、4、5、6、7、8、9 μmol/L的培养液，以1.5×105/孔在96孔板上接种细胞，将PBS处理组作为对照，继续培养细胞24、48 h后，将预先配制好的CCK-8混合液加入培养孔中，置于恒温培养箱中1 h。在450 nm处用酶标仪检测实验组的吸光度A450值，重复检测3次。细胞增殖抑制率(PE)=[(对照PBS孔A450-实验孔A450)/(对照PBS孔A450-空白孔A450)]× 100%。

1.2.3 采用流式细胞术测细胞凋亡率 配制番茄碱浓度0、1.5、3、6 μmol/L含10%胎牛血清的培养基，以0 μmol/L浓度为对照组。取对数生长期的细胞在4孔板上于37℃、5% CO2培养箱中处理1 d后用冷缓冲液冲洗细胞，消化并离心收集细胞在管中。向管中加入300 μL 1×Binding Buffer和5 μL异硫氰酸荧光素(FITC)，放于室温下阴暗处15 min。上机检测前5 min，每支细胞中再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液并补充200 μL 1×Binding Buffer。检测食管癌Eca-109细胞早期、晚期和总体凋亡率，重复检测3次，利用FlowJo软件处理数据。

1.2.4 采用Western Blot法测细胞中NF-κB p65、VEGF蛋白表达 提取上述1.2.3各组细胞的相关蛋白，加入含苯甲基磺酰氟的裂解液，低温离心半小时，留取上清液体，用BCA测定NF-κB p65、VEGF蛋白浓度。配置凝胶，恒压电泳2 h后选用PVDF进行转膜，转膜电流设定为300 mA。转膜完毕，立即漂洗，封闭过夜。取出膜加入一抗，放置于摇床上摇动孵育1 h，加入洗涤液，漂洗3次后加入二抗，显色后使用image J分析灰度值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 CCK-8法实验结果表明，1、2、3、4、5、6、7、8、9 μmol/L浓度番茄碱培养液处理食管癌细胞24、48 h后，增殖抑制率随浓度增加而显著增加(F=991.597，P<0.001)，呈剂量依赖性，当番茄碱浓度>6 μmol/L时，Eca-109的增殖抑制率达到90%，几乎不存活，而不同时间组间的差异无统计学意义(F=0.22，P>0.05)，之后实验浓度控制在6 μmol/L，否则大于此浓度细胞几乎不能存活。见图1。

图1 不同浓度番茄碱中食管癌Eca-109细胞增殖抑制率的变化

2.2 各组食管癌细胞的凋亡率比较 不同浓度番茄碱处理食管癌Eca-109细胞24 h后，3 μmol/L番茄碱组和6 μmol/L番茄碱组的细胞平均早期凋亡率、晚期凋亡率和总体凋亡率增加，与对照组(0 μmol/L番茄碱)差异有统计学意义(P<0.05)；而1.5 μmol/L番茄碱组与对照组(0 μmol/L番茄碱)细胞相比，凋亡率差异小，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表1。

注：A：对照组(0 μmol/L番茄碱)；B：1.5 μmol/L番茄碱；C：3 μmol/L番茄碱；D：6 μmol/L番茄碱

表1 番茄碱对食管癌细胞凋亡的影响

2.3 各组细胞NF-κB p65与VEGF蛋白表达比较 与对照组(0 μmol /L番茄碱)对比，3、6 μmol/L番茄碱组中的NF-κB p65蛋白表达量[(0.46±0.022)、(0.17±0.035)]与VEGF蛋白表达量[(0.35±0.02)、(0.07±0.00)]都显著下调(P<0.001)；1.5 μmol/L番茄碱组与对照组(0 μmol/L番茄碱)相比，NF-κB p65与VEGF蛋白表达量[(0.95±0.040)、(0.95±0.058)]无显著变化，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3～4。

图3 Western blot检测NF-κB p65和VEGF蛋白表达

注：*与对照组比较P<0.001

3 讨论

中药在恶性肿瘤的预防和诊断中有着独特的优势，其生物碱类有效成分广泛应用于对抗恶性肿瘤[13-14]。番茄碱的天然高效药理效力，不但能抗菌[15]、降脂[16]、增强免疫力[17]、抗炎[18]，而且对多种实体瘤还可发挥抗肿瘤的作用[19-20]，但目前番茄碱对食管癌影响的研究报道极少。Yan等[21]研究表明番茄碱通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的表达来抑制肺癌A549细胞的侵袭；番茄碱亦能够对人非小细胞肺癌细胞NCI-H460产生显著抑制[22]。本实验研究表明，经过番茄碱处理的食管癌Eca-109细胞，增殖抑制率及凋亡率明显增加，药物体外作用研究结果显示：>1 μmol/L的番茄碱作用食管癌Eca-109细胞24 h即可对肿瘤细胞的存活和生长状态产生影响，当番茄碱浓度>5 μmol/L时，Eca-109细胞基本不能存活，这提示番茄碱具有高效抗食管癌细胞的作用。本研究的CCK-8实验和流式细胞术也显示：在一定范围内，随着番茄碱浓度增加，其对Eca-109细胞增殖抑制和促凋亡能力相应增加。

NF-κB活化使一氧化氮合酶(NOS)、环氧合酶-2(COX-2)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症相关因子上调，使炎症反应慢性低表达，有利于肿瘤发展、浸润及转移[23-24]。通过诱导肿瘤细胞凋亡药物，不但可以抑制激酶复合物，使NF-κB不能转位进细胞核与相应基因结合[25]，并且还可以阻断该通路与DNA结合后对肿瘤细胞提供的保护，使肿瘤细胞不能维持增殖性的特征[25-26]。血管内皮生长因子在体内经刺激已有血管和改变微血管通透度使其增生。VEGF与血管内皮生长因子受体结合，由激酶催化使自身磷酸化(autophosphorylation)，激活有丝分裂原，活化相关蛋白激酶(MAPK)，诱导血管内皮增生从而使为肿瘤增殖、生长、侵袭提供充足血管供应[27-28]。NF-κB使炎症持续低表达持续和肿瘤细胞的大量增殖不断加重了肿瘤微环境中的缺氧状态,在食管癌发展早期，转录因子的表达主要由基因突变引起，而在进展期，食管癌发生、发展的相关通路进一步活化与肿瘤微环境的不断失控导致恶性循环，两者共同加剧肿瘤恶性增殖[29]。因此，抑制肿瘤细胞中NF-κB的活性并且抑制VEGF因子生成是抗肿瘤治疗的主要思路之一。本研究的结果显示，番茄碱处理后的Eca-109细胞的NF-κB p65、VEGF蛋白表达降低，说明番茄碱对NF-κB、VEGF有抑制作用。还有文献表明番茄碱促凋亡作用还可通过抑制肿瘤坏死因子TNF-α诱导的NF-κB依赖的促生存蛋白实现，这也有可能是番茄碱抗癌的机制之一[30]。

综上所述，本研究阐明了番茄碱能够抑制食管癌Eca-109细胞的增殖，促进肿瘤细胞的早期凋亡和晚期凋亡，抑制Eca-109细胞中NF-κB p65、VEGF蛋白的表达，减少相关通路对肿瘤细胞保护机制和血管生成，从而影响食管癌的发生、发展。实验结果可为番茄碱对人食管癌药理作用提供基础研究，但其作用机制及作用靶点还有待进一步深入研究。

利益相关声明：本文所有作者均声明不存在相关利益冲突。

作者贡献说明：万泽浩负责实验总体设计、具体实施和论文的起草、撰写；王丁悦负责实验部分的设计、数据分析和论文的修改；芦梓楠、冯修来对实验设计给予修改和协助实验进行；米日亚·买明负责论文的图表图表的制作和标注；依力夏提·马木提负责参考文献的检索、总结；吕红博对论文提出了建设性的意见。