植物无糖培养微繁殖技术在苹果工厂化育苗中的应用

杨成贺 姜世豪 肖玉兰

（1上海离草科技有限公司，上海 200240；2浙江清华长三角研究院，嘉兴 314006）

实践表明，采用苹果脱毒种苗进行栽培生产，能有效增强苹果树的树势，提高苹果树的抗逆性，进而提高苹果的产量和品质，故目前苹果脱毒种苗的市场需求量巨大。但是，目前的苹果脱毒种苗主要是依靠传统的植物有糖组培技术来获得的，且在苹果脱毒种苗的有糖组培工厂化生产过程中，存在着植株生根慢、长势弱、缓苗期长、成苗率不高等问题，这些均制约了苹果脱毒种苗的规模化和产业化生产。而大量研究表明[1-2]，相比传统的植物有糖组培技术，应用植物无糖培养微繁殖技术（该技术又称光自养微繁殖技术，是指容器中的小植株在人工光照条件下，通过吸收CO2进行光合作用，以完全自养的方式进行生长繁殖）进行组培苗的繁育，能有效促进组培苗的生长和发育，大幅度降低组培污染率，明显缩短整个生产周期。因此，有望在苹果工厂化育苗中进行植物无糖培养微繁殖技术应用。在此背景下，笔者进行了植物无糖培养微繁殖技术在苹果工厂化育苗过程中的生根培养阶段的应用试验，并在陕西青美生物科技有限公司进行了该技术的实际应用，以期促进该技术在苹果工厂化育苗中的应用，及为该技术在其他作物上的应用提供参考借鉴。现将相关试验结果和该技术的实际应用情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验以苹果矮化砧木品种M9T337增殖培养30 d的试管苗为材料，选取平均高度为3.04 cm、叶片数为9.6张、鲜重为108.4 mg、干重为13.5 mg的单株试管苗作为生根培养的接种材料。

1.2 试验设计

试验设2个处理：（1）无糖培养微繁殖。该处理采用上海离草科技有限公司开发生产的植物无糖培养系统（该系统由培养容器、空气过滤装置、自然换气装置和强制换气装置组成，相关设备安装于培养室组培架上，培养室独立配备CO2供给系统和补光灯）。接种容器是尺寸为28 cm（长)×22 cm（宽）×15 cm（高)的长方形底无糖培养盒，每盒加入含水量为35%（重量比）的无菌蛭石350 g、无糖液体培养基（培养基为1/2 MS培养基，不加糖、琼脂、激素和有机物，pH为5.8）800 mL，每盒接种苹果试管苗150株，合计接种6盒，作为3次重复（每重复2盒）。培养时间为30 d，培养温度为25±2℃，光照强度为100±18 μmol/（m2·s），光照时数为14 h/d，CO2浓度为 800～1 000 μmol/mol，培养室通气时间与光照时间相同。（2)有糖培养微繁殖。该处理的培养基为1/2 MS+IAA 0.3 mg/L+琼脂4.2 g/L+蔗糖30 g/L、pH 5.8，接种瓶为7 cm(直径)×9 cm(高)的圆形底组培瓶，每瓶接种苹果试管苗8株，合计接种114瓶，作为3次重复（每重复38瓶）。培养时间为40 d，培养光照强度为50±18μmol/(m2·s），其他培养条件与无糖培养微繁殖处理相同。

1.3 调查项目及方法

分别在无糖培养30 d和有糖培养40 d后，每处理随机抽取30株生根苗，测定生根苗的株高、单株叶片数、单株鲜重、单株干重和单株根数，随后两个处理的所有生根苗均转移到温室进行炼苗和移栽，分别统计成活率。

2 结果与分析

2.1 不同培养方式的苹果试管苗生长情况

由表1可知，无糖培养微繁殖处理的苹果试管苗的平均株高为7.68 cm、单株叶片数为14.8张、单株鲜重为720.1 mg、单株干重为81.4 mg，有糖培养微繁殖处理的苹果试管苗的平均株高为3.59 cm、单株叶片数为10.4张、单株鲜重为220.6 mg、单株干重为26.3 mg，无糖培养微繁殖处理的苹果试管苗的株高、单株叶片数、单株鲜重、单株干重分别是有糖培养微繁殖处理的苹果试管苗的2.1倍、1.4倍、3.3倍、3.1倍，表明无糖培养微繁殖处理的苹果试管苗的长势明显优于有糖培养微繁殖处理的苹果试管苗。同时，无糖培养微繁殖处理的苹果试管苗的生根率为94.67%、平均单株根数为8.2条，且根部无愈伤组织，根系呈白色、粗壮，不同植株间根系的生长发育差异较小；而有糖培养微繁殖处理的苹果试管苗的生根率为90.02%、平均单株根数为6.4条，根部有较为明显的愈伤组织，根系呈淡黄色，不同植株间根系的发育差异较大。

表1 不同培养方式的苹果试管苗生长情况

2.2 不同培养方式的苹果试管苗炼苗和移栽情况

由表2可知，无糖培养微繁殖处理的苹果试管苗在生根培养30 d后，即可转移到温室进行炼苗（即将培养容器开盖置于温室中，使苹果生根苗适应外界环境），炼苗5 d后即可进行移栽（即将苹果生根苗带蛭石直接从培养容器中栽种至育苗杯中，并浇透水），遮阳缓苗处理3 d后即可除去遮阳设施进行苹果种苗的正常管理，从苹果试管苗生根培养到温室种苗的正常管理，无糖培养微繁殖处理合计需要38 d，且种苗移栽成活率高，达83.22%。有糖培养微繁殖处理的苹果试管苗在生根培养40 d后，才能转移到温室进行炼苗（即将组培瓶置于温室中，先不开盖过渡适应7 d，再开盖缓苗处理7 d），炼苗14 d后进行移栽（为保证移栽成活率，需先进行生根苗根系上的琼脂清洗处理工作，然后将生根苗栽种在育苗杯中，并浇透水），遮阳缓苗处理7 d后才可进行苹果种苗的正常管理，从苹果试管苗生根培养到温室种苗的正常管理，有糖培养微繁殖处理需61 d，且种苗移栽成活率仅为58.83%，明显低于无糖培养处理（表2）。

表2 不同培养方式的苹果试管苗炼苗和移栽情况

3 植物无糖培养微繁殖技术在苹果工厂化育苗中的应用实例

目前，上海离草科技有限公司开发了可以直接用于苹果脱毒种苗工厂化生产的植物无糖培养系统，该系统经陕西青美生物科技有限公司应用（该公司当前已投入使用的无糖培养室面积为300 m2），每月可生产苹果无糖组培苗约52万株，相比于传统的有糖组培技术，种苗数量提高了1.4倍，种苗繁育周期缩短了一半，种苗移栽成活率得到了保证，培养室单位面积利用率也有了一定程度的提高。见表3。

表3 无糖培养微繁殖技术与有糖培养微繁殖技术的应用对比

4 结论与讨论

4.1 关于植物无糖培养微繁殖技术在苹果工厂化育苗中的应用优势

4.1.1 植株长势好

在传统的植物有糖组培中，植物主要以糖为碳源，以异养的方式来获取其植株生长所需的养分，而在植物组培过程中，培养基中的糖是造成污染的主要原因之一，故为了减少污染，在组培过程中，不得不使用封闭的、小的培养容器，以减少容器与外界的气体交换，这就导致培养容器内的环境条件不便于调控，植物生长在透气性差且高温高湿的环境中，造成了其植株长势差、生长发育不良甚至死亡。而采用植物无糖培养微繁殖技术，植物的碳源来自于空气中的CO2，培养基中不添加糖，可使用大空间的培养容器，这不仅大大减少了污染的发生，还便于培养容器内部环境条件的调控[3]，使植物生长在适宜的温度和湿度下，且通过提高培养容器内部的光照强度和CO2浓度，可以极大地促进其植株的光合作用，使植株的干物质积累和生长发育速度加快，故最终培养出的种苗在植株长势方面表现较好，明显优于有糖培养苗[4]。例如，肖玉兰等[5]比较了非洲菊的无糖培养苗和有糖培养苗，无糖培养苗的植株在长势和干物质积累方面明显优于有糖培养苗；和世平[6]在进行半夏无糖培养研究时发现，半夏无糖组培苗的株高显著高于有糖组培苗。在本试验中，采用无糖培养微繁殖技术培养出的苹果种苗的植株长势也显著优于采用有糖培养微繁殖技术培养出的苹果种苗，进一步证实了植物无糖培养微繁殖技术在木本植物组织培养上应用具有一定的优势。

4.1.2 生根质量高

传统的植物有糖组培中常常使用凝胶状的物质（如琼脂、卡拉胶等）作为生根培养基质，这些培养基质的透气性极差，且在进行灭菌后，其中的O2已完全散失，这不利于植株的根系生长发育，导致生长发育出的根系细弱，移栽时根系易受到损伤。而植物无糖培养可以采用多孔的无机物质（如蛭石、珍珠岩、沙等）作为生根培养基质，这些培养基质有较高的空气扩散系数，透气性较好，可大大改善植物的生根环境，有助于根系对养分的吸收，进而促使根系早生快发，且生长发育良好[7]。在本试验中，采用无糖培养微繁殖技术的苹果试管苗的生根率比采用有糖培养微繁殖技术提高4.65%，生根质量也明显提高，这与本试验采用多孔的蛭石作为生根培养基质有极大的关系。采用多孔的生根培养基质有利于提高植物组培苗的生根质量这一结论，在桉树、甘薯、咖啡、山竹果等多种作物上均得到了验证[1]。例如，祁永琼[8]在仙客来的无糖组培中，使用蛭石和珍珠岩作为生根培养基质，与使用琼脂作为生根培养基质的有糖培养相比，无糖培养苗的根系发育和生根率均优于有糖培养苗。

4.1.3 生产周期短

在本试验中，无糖培养微繁殖处理的苹果种苗生产时间比有糖培养微繁殖处理减少了23 d，且最终的种苗移栽成活率提高24.39%。究其原因：植物有糖培养容器内苹果试管苗的生长环境与外界环境的差异较大，且高温高湿的环境易造成苹果试管苗的组织结构和气孔功能异常，在苹果生根苗向瓶外过渡时，苹果生根苗需要进行营养方式的转变（即异养→自养），并需要逐渐恢复正常的组织结构和气孔功能来适应外界环境条件，这个过程需要繁琐的炼苗程序和较长的时间。而无糖培养微繁殖处理可通过环境条件调控，使培养容器内苹果试管苗的生长环境与外界环境高度相似，故苹果生根苗对外界环境的适应能力较好，再加上苹果生根苗植株能够保持正常的组织结构和气孔功能，能以完全光合自养的方式来获取其生长所需的养分，且具有较高的光合能力，故苹果生根苗在炼苗和移苗时，无需进行营养方式的转变，这不仅大大缩短了炼苗时间，还保证了良好的移栽成活率。因此，在苹果工厂化育苗中应用无糖培养微繁殖技术，能够有效缩短苹果种苗的生产周期，简化移苗过渡程序。

4.2 关于植物无糖培养微繁殖技术的发展和应用

植物无糖培养微繁殖技术在苹果工厂化育苗中的成功应用，为其他作物工厂化育苗提供了良好的参考借鉴，相信在未来的种苗工厂化生产中，植物无糖培养微繁殖技术将有着非常广阔的应用前景。

值得注意的是，植物无糖培养微繁殖技术在应用时，对其培养容器内部的环境条件调控显得极为关键，这也对培养容器提出了较高的要求。目前，关于植物无糖培养装置的开发，国内外已进行了不少试验和研究[9]，但以往研发出的无糖培养装置多为大体积的箱式培养系统，该类系统对培养室的改造要求较大，且价格昂贵，再加上植物无糖培养微繁殖技术在前期的接种操作和后期的培养管理上，均较为不便，这就导致植物无糖培养微繁殖技术难以在种苗规模化和产业化生产上进行应用，相关装置设备也难以在组培苗生产中进行大面积应用，这些问题均有待进一步研究解决。