红松种子园单株ISSR-PCR遗传多样性分析

童茜坪 剡丽梅 张磊

摘要：  以林口青山红松无性系种子园216个单株生健康嫩叶为试验材料，利用ISSR-PCR分子标记技术分析其遗传多样性的试验结果表明：从100条引物中共筛选出11条具有多态性的ISSR引物，经ISSR-PCR扩增后共获得102个位点，多态性谱带102条，多态位点比率为100%，单株有效等位基因数变动范围为1.004 6～2.000，群体总基因多样性指数为0.333 3，Shannon多样性指数为0.016 4～0.693 1，期望杂合度为0.004 6～0.500 0，红松种子园单株具有丰富的遗传多样性。

关键词：  ISSR;  红松;  单株;  遗传多样性

中图分类号：   S 722. 8 + 3，  S 791. 247               文献标识码：   A                文章编号：1001 - 9499（2020）02 - 0017 - 04

红松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc）为松科松属的乔木植物， 分布于中国东北长白山和小兴安岭，是我国东北地区的顶级森林植被建群树种，也是优良的用材和油料树种。不同物种的遗传物质是不同的，物种的遗传多样性越丰富，适应环境变化的能力就越强[ 1 - 8 ]，而物种遗传多样性研究一直是生物学研究的重点。ISSR分子标记技术具有简单、快捷和成本低的特点，已广泛的应用于遗传多样性分析、遗传育种、种植资源鉴别等内容[ 9 - 17 ]。李雪峰通过利用ISSR和RAPD两种标记方法对兴安落叶松105个无性系个体进行遗传多样性分析，从分子水平上证明了兴安落叶松种源具有丰富的遗传多样性[ 18 ]。冯富娟等对露水河天然种群和种子园内红松优良无性系的遗传多样性的研究[ 19 ]。邱新宇应用ISSR标记了青山种子园长白落叶松种子园单株样本[ 20 ]。魏利以引种俄罗斯的西伯利亚红松不同地理分布区的19个种群为材料，应用ISSR分子标记技术，进行西伯利亚红松遗传多样性以及种群划分，证明西伯利亚红松种群具有丰富的遗传多样性[ 21 ]。当前，对红松分子标记遗传多样性的研究仍然较少，东北林业大学利用已经开发的落叶松ISSR分子标记，优化了红松ISSR分子标记技术，这对其辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等研究均具有重要意义。本研究采用黑龙江省林口青山红松无性系种子园的红松单株，从DNA水平上分析遗传多样性，为红松无性系分子鉴定与遗传保护提供理论依据。

1 试验材料与方法

1. 1 试验材料

試验材料为黑龙江省林口青山红松种子园定植的216株红松单株，1974年定砧木，1978年嫁接，接穗来源于五营林业局。2017年7月4日，采取当年生幼嫩健康嫩叶，将灰尘杂物擦净，分别编号，置于冰盒保存，带回试验室后于冰箱-80 ℃冷冻保存。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA的提取与检测

利用试剂盒提取红松总DNA，定容不少于50 uL洗脱缓冲液（北京天根生化科技有限公司生产）。提取的DNA置于冰箱-40 ℃保存备用。使用电泳仪（DYY-2C，北京六一生物科技有限公司生产），用2.0%的琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收法检测DNA质量，电泳观察DNA条带清晰明亮，无明显杂带，则说明DNA完整性较好。样品DNA最终浓度应大于50 ng/uL，以80～100 ng/uL为最宜，DNA在260 nm和280 nm波长下的吸光度比以OD260/OD280=1.7～1.9为宜。若样品DNA OD260/OD280在2.0～2.3之间，则说明DNA中有RNA污染。

1. 2. 2 引物筛选

参照加拿大不列颠哥伦比亚大学（UBC）公布的100条ISSR引物序列（上海生工公司合成），随机选取3个单株作为模板进行引物筛选，初筛出44条能扩增出条带的引物，再进一步选取11条扩增条带多且清晰的引物用于后续PCR扩增。

1. 2. 3 ISSR-PCR反应体系和扩增程序

扩增体系25 uL的PCR反应液：模板DNA 1 uL，Taq DNA 聚合酶（5U/uL） 1 uL，10×PCR Buffer 2.5 ul，DNTP 2 ul，引物（10 μmol/L） 1 uL，ddH2O 17.5 uL。扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃（引物TM+5 ℃）退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环， 72 ℃补延伸7 min[ 23 ]。从多次试验结果来看，该体系能有效扩增片段，减少PCR仪的损坏率。

1. 2. 4 数据统计与遗传多样性分析

利用ISSR反应产生的凝胶电泳图谱，与2 000 bpMaker进行比对分析PCR扩增产物片段的大小，按扩增条带的有无记为“1”和“0”，统计条带数并建立0～1矩阵。利用Popgene32软件计算红松216个单株的多态性位点数 （N， number of polymorphic loci）、多态性位点百分率（PPL， percentage of polymorphic loci）、有效等位基因数（Ne， effective number of alleles）、期望杂合度（He，Nei's gene diversity）、Shannon多态性信息指数（I ，Shannon's Information index） [ 24 - 26 ]。

2 结果与分析

2. 1 DNA质量检测

由红松基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1）可以看出：DNA窄带较亮且比较集中，未发现有拖带弥散现象，提取的红松DNA样品浓度及纯度符合后续试验的要求。

2. 2 引物筛选

根据电泳结果，从100条引物中筛选出11条谱带清晰、差异明显、重复性和稳定性高的引物，引物名称及序列见表1。

2. 3 ISSR-PCR扩增

利用11个引物对红松216个单株的DNA样品进行ISSR-PCR扩增，共检测到102个位点，位点范围为250～3 000 bp，多态位点有102个，多态位点比率高达100%。多态位点比率反映了群体遗传变异水平的高低，对环境适应能力强的群体多态位点比率也比较高[ 19 ]，试验结果说明不同红松单株对该地区的适应性极强，存在较高水平的变异。不同引物扩增的多态性条带在4～15条之间，平均每个引物扩增9.27个条带，其中，引物UBC841扩增位点最多，多达15个位点，多态位点百分率为60.49%，其它引物UBC864、UBC835、UBC823、UBC808多态位点百分率也在50%以上，这说明ISSR分子标记技术在检测红松基因组遗传多态性上有较好的检出效率。

2. 4 单株遗传多样性分析

由红松ISSR单株多态性位点分析（表2）和红松单株之间的遗传相似性和遗传距离（表3）可以看出：（1）单株等位基因数为2.000，有效等位基因数变动范围为1.0046～2.000，其中，第57号单株有效等位基因数最小，第92号单株有效等位基因数最大。（2）Nei's指数（期望杂合度）为0.004 6～0.500 0，Shannon多样性指数为0.016 4～0.693 1，群体总基因多样性指数为0.333 3，总信息指数为0.495 4。表明群体中单株之间分化强烈，遗传变异差别较大。（3）遗传一致度变化范围为0.352 9～0.951 0，遗传距离范围为0.050 3～1.041 5，变化幅度较大，说明216个红松单株之间的亲缘关系较远。其中，第42和43单株遗传一致度最大（0.995 10），遗传距离最小（0.050 3），说明这两个单株之间遗传分化最小，亲缘关系最近，极大可能性来源于同一个无性系。第99和31，32单株之间遗传一致度最小（0.352 9），遗传距离最大（1.041 5），表明第99号单株与31，32单株之间遗传分化最大，亲缘关系最远。

3 结论与讨论

对红松种子园单株样本进行ISSR显性标记，得到多态性谱带102条，多态位点比率高达100%，Nei's指数为0.004 6～0.500 0，Shannon多样性指数为0.016 4～0.693 1，遗传距离为0.050 3～1.041 5，这表明林口青山红松种子园中各单株之间遗传变异明显，亲缘关系变幅大，多态性高对环境適应强。对比邱新宇运用ISSR标记长白落叶松种子园单株样本结果[ 20 ]，林口青山红松种子园单株多态性更高对环境的适应能力更强，遗传多样性更高，群体总体遗传变异水平更高，单株间分化强烈，遗传变异变化幅度更广，可提供大量无亲缘关系的优良红松种子。由此可以认定，林口青山种子园的红松单株无性系有较高的遗传多样性水平，且并未在人工栽培驯化过程中丢失大量遗传变异，更容易扩展其分布范围，拥有较高的进化潜力，可用于大量培育优质红松单株。

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第1作者简介：  童茜坪（1998- ），  女，  本科，  研究方向：  林木遗传育种。

通讯作者：  张含国（1962- ），  男，  教授，  博导，  研究方向：  林木遗传育种。

收稿日期： 2020 - 01 - 20

（责任编辑：   王 岩）

Abstract With healthy young needles from 216 single plant of Pinus koraiensis in the seed orchard of Linkou， we studied the genetic diversity by ISSR markers. The results showed that 11 polymorphic ISSR primers were screened from 100 primers. After ISSR-PCR were amplified， a total of 102 loci were obtained， and there are 102 polymorphic loci， whose average polymorphism percentage was 100%. The variation range of effective alleles per plant was 1.004 6～2.000. The total genetic diversity index of population was 0.333 3. The Shannon diversity index was 0.016 4～0.693 1， and Nei's gene diversity index was 0.004 6～0.500 0. Finally， Pinus koraiensis in seed orchard had abundant genetic diversity.

Key words ISSR;  Pinus koraiensis;  Individual;  Genetic diversity