金属硫蛋白家族对膀胱癌预后和免疫微环境的影响

丁燕鹏 刘诺敏 陈梦戈 方 莎 向文彬 於海军

武汉大学中南医院放化疗科/湖北省肿瘤生物学行为重点实验室/湖北省肿瘤医学临床研究中心湖北 武汉 430071

膀胱癌是泌尿系统第二大常见癌症，全球新诊断病例约43万例［1］。其中浅表型肿瘤约占70%，可行经尿道膀胱切除术（transurethral resection of the bladder,TURB）治疗；虽然浅表型一般不会危及生命，但其复发的风险较高［2］。而伴有肌肉浸润的患者预后差，远处转移率高［3］。以顺铂为基础的全身化疗目前仍是膀胱癌晚期及转移性患者的一线治疗手段，但该治疗的复发率未见改善［4］。此外，半数伴有肌肉浸润的患者不宜使用顺铂治疗，对于这些患者尚无有效的标准治疗方法［5］。膀胱癌发病的潜在分子机制目前尚不清楚，探讨本病的发病机制以及影响预后的因素具有重要的意义。

伪基因MT 1L属于金属硫蛋白（metallothioneins,MTs）家族［6］。已有证据表明，MTs可以通过结合重金属，如锌/铜［7，8］，调节细胞生长、增殖，保护机体免受氧化应激、抗肿瘤药物和辐射的影响。在人类中，有4种亚型的MT-2、MT-3和MT-4蛋白质是由单个基因编码。MT-1A、-1B、-1E、-1F、-1G、-1H、-1M、-1x是属于MT-1的活性基因。其余MT-1基因（MT-1C、-1D、-1I、-1J、-1L）为伪基因［9］。伪基因是人类基因组中大量存在的一类非编码RNA，它们控制同源编码蛋白基因的表达，但由于编码序列存在不同类型的突变而不能编码功能性蛋白［10］。近年来，越来越多的证据表明，伪基因在各种疾病中发挥着重要作用，尤其是在人类的癌症中［11］。一些与肿瘤相关的伪基因已被证明是人类癌症的生物标志物。例如，一种名为DUXAP10的伪基因在各种癌症中上调。它可通过激活PI3K/AKT通路促进肝细胞癌细胞增殖，并可作为一种独立的肝细胞癌的预后生物标志物［12，13］。此外，一些伪基因也被证实参与了多种癌症的进展，如乳腺癌、胃癌和胆 囊 癌［14，15］。伪 基 因 在 癌 症 中 的 重 要 作 用 不 容忽视。

我们从金属硫蛋白家族中筛选出了与膀胱癌预后显著相关，并与膀胱癌中免疫细胞浸润密切相关的伪基因MT 1L，其在膀胱癌中的功能在先前的研究中尚未被阐明。GEPIA和UALCAN等数据库以及R-4.0.2验证了其在人类癌症中的表达和预后价值，TISIDB数据库证实了MT 1L与肿瘤浸润性免疫细胞的关联。

1 材料与方法

1.1 数据采集从癌症基因组图谱(TCGA)数据库［16］中筛选出408例膀胱癌患者的临床随访信息和RNA测序数据；剔除总体生存时间、TNM分期以及肿瘤分级数据不足或缺失的病例。

1.2 GEPIA分析使用基因表达谱交互分析（GEPIA）数据库进（http：//gepia.cancer-pku.cn/）行差异表达分析，以确认MT 1L在不同人类癌症类型及相应正常组织中的表达水平是否有差异。P＜0.05被认为是差异具有统计学意义。

1.3 TIMER使用肿瘤免疫评估资源（TIMER）数据库（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）评估了在膀胱癌中MT 1L表达与典型免疫细胞标志物的关系。P＜0.05被认为是差异具有统计学意义。

1.4 TISIDB使用肿瘤免疫系统交互分析的集成门 户（TISIDB）数 据 库（http：//cis.hku.hk/TISIDB）来推断膀胱癌中MT 1L的表达与免疫细胞和免疫调节因子的相关性，以Spearman相关系数ρ＞0.1作为判断MT 1L表达对免疫微环境影响的基准。

1.5 UALCAN分析我们利用UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu），获得了在膀胱癌中伪基因MT 1L对生存的影响。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.6 基因富集分析（GSEA）本研究旨在揭示MT 1L表达水平所影响的关键生物学过程及相关信号通路。P＜0.05和富集评分（NES）＞1.5被认为是具有统计学差异。

1.7 统计学分析从TCGA下载了病人的临床信息，使用R-4.0.2进行数据分析。行逻辑回归法和多因素Cox回归分析探讨MT 1L在膀胱癌中的预后价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金属硫蛋白家族中与膀胱癌生存时间显著相关基因的筛选我们分别使用GEPIA和UALCAN数据库筛选金属硫蛋白家族中表达量在膀胱癌组织与正常组织有显著差异的基因，结果显示在MT 1A～MT 1X中，只有MT 1L符合筛选条件。如图1A所示，膀胱癌肿瘤组织中MT 1L的表达水平显著低于相邻正常组织，这意味着MT 1L的表达水平可以将肿瘤组织和正常组织区分开来。如图1B，在膀胱癌中，MT 1L的表达水平越高，则意味着总体生存时间（OS）越短（n=406，P=0.002 3）。

图1 GEPIA数据库分析MT1L在正常组织和膀胱癌组织中的表达水平差异（A）及UALCAN分析MT1L表达水平与膀胱癌总体生存期的关系（B）

2.2 MT1L在膀胱癌中的预后价值基于TCGA数据库，我们使用逻辑分析探讨了伪基因MT 1L表达水平与膀胱癌的临床病理特征的相关性。剔除不合格的病例后，一共有408例纳入本次分析。通过逻辑回归分析，我们发现伪基因MT 1L与多种临床病理特征相关，具有很好的诊断膀胱癌的价值。如表1所示，MT 1L的表达水平与膀胱癌患者的年龄（P=0.039）、体质量（P=0.01）、种族（亚洲人vs其他，P=0.043；亚洲人vs白种人，P＜0.001），N（N0vs＞N0，P=0.026）、分期（Ⅰ～ⅡvsⅢ，P＜0.001；Ⅰ～ⅡvsⅣ，P＜0.001）、T分期（＜T 2vsT 3，P＜0.001；＜T 2vsT 4，P=0.001）、分级（高vs低，P=0.003）相关。为了进一步确认伪基因MT 1L的临床诊断价值，我们进行了多因素Cox分析，如表2所示，MT 1L表达水平、肿瘤分期和携瘤状态都可作为膀胱癌的独立预后因素。

表1 MT1L的表达与临床病理特征的关系

表2 各临床特征的独立预后价值

2.3 MT1L与膀胱癌中肿瘤免疫细胞浸润密切相关肿瘤免疫浸润相关的淋巴细胞是预测总生存率种必不可少的因素。TISIDB是一个综合性的肿瘤免疫分析的网站，整合了五大数据库的资源。因此，我们选择TISIDB明确在膀胱癌中MT 1L与免疫浸润淋巴细胞（TILs）以及免疫调节剂的Spearman相关性（图2）。结果同样显示MT 1L与免疫浸润淋巴细胞之间的强相关性，如效应CD8+记忆T细胞（Tem-CD8）（ρ=0.549，P＜0.001），中央CD8+记忆T细胞（Tcm-CD8）（ρ=0.493，P＜0.001），滤泡辅助性T细胞（Tfh）（ρ=0.619，P＜0.001），调节性T细胞（Treg）（ρ=0.708，P＜0.001），自然杀伤T细胞（NKT）（ρ=0.683，P＜0.001），骨髓来源的抑制细胞（MDSC）（ρ=0.664，P＜0.001）。另外如图2中所示，与其他人类癌症相比，在膀胱癌中MT 1L表达与TILs之间的整体相关性最显著（红色方块数目最多）。对于免疫抑制剂，MT 1L表达与CSF1R、HAVCR2、IL 10、PDCD1和PDCD1LG2表现出很强的相关性。因此，MT 1L在肿瘤免疫微环境中，尤其是在膀胱癌中，是一个重要而且独特的调节因子。

图2 M T1L的免疫调节功能分析

2.4 在膀胱癌中MT1L与典型免疫细胞标志物的相关性我们通过TIMER数据库探究了MT 1L表达与典型免疫细胞标志物之间的关系。如表3所示，在膀胱癌中，MT 1L的表达与CD8+T细胞标志物、通用T细胞标志物（CD3E、CD2）、单核细胞标志物（CD86）、自然杀伤细胞标志物（KIR2DL 3、KIRIDL4）、树突细胞标志物（HLA-DPB1、HLADQB1、HLA-DPA 1）和功能性T细胞标志物，包括辅助性T细胞（Th1）标志物（IFNG、TNF）、调节性T细胞（Treg）标志物（ENTPD1）和T细胞衰竭标志物（PD-1、CTLA 4）呈显著正相关。值得注意的是，我们发现MT 1L与单核细胞和M 2巨噬细胞具有很强的相关性，这意味着MT 1L可能在膀胱癌中调节巨噬细胞的极化。

表3 TIM ER数据库分析的M T1L与典型免疫细胞标志物关系的结果

另一点值得注意的是，MT 1L与树突状细胞（DCs）标志物（NRP1、ITGAX）之间的强烈相关性。研究证明DCs通过增加Treg细胞和降低CD8+T细胞的细胞毒性来促进肿瘤细胞的转移［17］。MT 1L的表达与T细胞衰竭和Treg标志物如LAG3、TIM-3、GZMB、FOXP3、IL 2RA、TGFB1之间存在不可忽视的强相关性。研究表明，FOXP3作为一个重要的因子，可以抑制细胞毒性T细胞攻击肿瘤细胞的作用［18］。此外，MT 1L与T细胞衰竭标志物的相关性表明，膀胱癌中MT 1L的高表达T细胞的衰竭密切相关。因此，以上结果证实了MT 1L在膀胱癌肿瘤微环境的免疫逃逸中的重要作用。

2.5 GSEA富集分析我们通过GSEA探索了在膀胱癌中MT 1L的表达水平所影响的关键生物学功能和相关的信号通路。如图3所示，GO富集分析表明，MT 1L参与肿瘤微环境中的T细胞、B细胞、巨噬细胞、淋巴细胞免疫细胞的调节，与之前免疫分析的结果一致。这些结果再次证实了MT 1L可能在肿瘤免疫中有着不可或缺的调节作用。

图3 GSEA富集结果图

3 讨论

MT 1L是一种在乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌等多种肿瘤组织中表达的伪基因［19］。已有学者证实MT 1L可作为结直肠癌的预后指标［20］。然而，关于MT 1L在膀胱癌中潜在的生物学影响的文献非常有限，因此我们进行了这次的分析研究。在这里，我们观察到膀胱癌中MT 1L的表达低于正常膀胱组织，这意味着MT 1L可以作为一个生物标志物以鉴别肿瘤组织和非肿瘤组织。Logistic回归分析显示膀胱癌组织中高MT 1L表达与高T、N分期和高肿瘤分级有关。因此，我们可以合理推测在膀胱癌中MT 1L与肿瘤的恶性生物学行为密切相关。此外，膀胱癌组织中MT 1L的高表达与膀胱癌患者较短的总生存时间显著相关（P＜0.05）。多因素Cox分析证实MT 1L可以作为BLCA的独立预后因素。

值得注意的是我们发现了在膀胱癌中，MT 1L的表达水平与多种免疫细胞标志物以及免疫细胞浸润的水平显著相关。近几年，免疫治疗改善了对泌尿系癌症（包括晚期膀胱癌）的干预手段［21］，在膀胱癌中取得了良好的疗效。然而不可否认的是，只有部分患者可以从免疫治疗中获益。作为一种高免疫原性的恶性肿瘤，膀胱癌的肿瘤免疫微环境的反应紊乱对肿瘤的发生发展起着决定性作用。因此膀胱癌的免疫治疗目前仍有许多有待解决的问题，寻找影响免疫细胞浸润水平的有效治疗靶点已成为当务之急。本研究表明MT 1L的表达与TILs浸润之间存在相关性。在30种肿瘤中，BLCA中MT 1L表达与TILs的相关性红色数量最多，即相关性最强（图2）。而在MT 1L的表达与免疫调节分子之间的相关性中也可以发现同样的结果。

TISIDB的免疫分析结果里，有一点吸引了我们的注意；在膀胱癌中，MT 1L的表达与调节性T细胞（Treg）的浸润水平（ρ=0.708）和骨髓来源的抑制细胞（MDSCs）的浸润水平（ρ=0.664）强相关。而膀胱癌的一个显著特点就是Tregs和MDSCs等免疫细胞显著浸润［22，23］。Tregs和MDSCs是BLCA中抗肿瘤反应的关键调节因子，它们的存在与较差的临床结局的相关性已得到多位学者的证实［24，25］。Tregs作为重要的免疫抑制因子，可以促进肿瘤的发生发展，抑制抗肿瘤免疫，并有助于肿瘤细胞的免疫逃避［26］。同样，MDSCs在肿瘤微环境中分布非常广泛，具有较强的免疫抑制活性，可以抑制细胞毒T细胞的增殖和活化，导致抗肿瘤免疫反应失效，并促进肿瘤的进展和化疗耐受［27］。因此，我们认为MT 1L在调节肿瘤免疫中起着至关重要的作用。

同样，免疫细胞表面标志物与MT 1L表达之间的关系也意味着MT 1L在调节膀胱癌的肿瘤免疫微环境中具有重要意义。根据TIMER的分析，MT 1L的表达与T细胞耗竭标志物（PD-1、CTLA 4）呈正相关。正常情况下，PD-L 1/PD-1相互作用可抑制CD8+T细胞的增殖和T细胞受体（TCR）介导的细胞毒性功能，从而避免自身免疫，减弱炎症反应［21］。PD-L 1与T细胞表面受体PD-1结合会导致T细胞功能的障碍，并导致T细胞的功能失活［28］。然而在膀胱癌中，MT 1L的高表达水平与免疫细胞高浸润水平呈正相关的同时，却也提示了较差的临床结局，这似乎是矛盾的；然而MT 1L的过表达与T细胞耗竭标志物之间的正相关为这个看似矛盾的现象提供了合理的解释。

此外，MT 1L与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和M 2巨噬细胞的标志物也具有很强的相关性，特别是与M 2巨噬细胞的表面标志物。TAM是肿瘤微环境的重要组成部分，其通过介导免疫抑制，促进肿瘤的增殖、转移和血管生成而在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，甚至参与肿瘤的耐药［29-31］。TAM可分化为M 1巨噬细胞或M 2巨噬细胞表型。临床研究表明肿瘤患者的不良预后与M 2巨噬细胞的数量显著相关［32］。而本研究中，MT 1L的表达与M 2巨噬细胞表面标志物的强相关性表明MT 1L可能参与巨噬细胞的极化，也部分解释了高表达MT 1L的膀胱癌患者预后不良的可能机制。因此，靶向MT 1L可减少TAM的浸润，特别是M 2巨噬细胞的浸润。这些证据明确了MT 1L作为一种新的靶向调节免疫细胞浸润的生物标志物的功能，为膀胱癌的免疫治疗提供了新的思路。

综上所述，金属硫蛋白家族中，只有伪基因MT 1L与膀胱癌的预后和免疫微环境相关，高表达MT 1L的膀胱癌患者Treg和MDSCs浸润水平较高，T细胞耗竭标志物以及肿瘤相关巨噬细胞和M 2巨噬细胞的表面标志物表达水平也较高，从而促进肿瘤的发生发展，导致肿瘤的免疫逃逸，抑制T细胞的活化并且参与肿瘤的耐药过程。因此，高表达MT 1L的膀胱癌患者其预后较差，MT 1L可以作为预测膀胱癌患者预后的标志物。然而，本研究缺少实验的支持，因此我们也非常期待其他学者关于MT 1L在膀胱癌中的进一步研究。