紫檀芪通过TLR4/NF-κB信号通路对肺纤维化大鼠的保护作用

彭艳芳 张莹雯 张亚兵 柯浩亮 王秀萍

武汉大学中南医院中医科 湖北 武汉 430071

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF)是多种因素引起的以炎性细胞浸润、肺间质及肺泡腔内纤维增生、胶原纤维沉积为特征的弥漫性间质性肺疾病［1］，具有慢性、进展性、致死性发展，预后差。临床上治疗肺纤维化大都会使用糖皮质激素，但只对部分患者有效，并且长期使用副作用大。目前肺移植为国际公认的最有效方法，但肺移植存在手术风险大、捐助机构的供应有限，且肺移植后长期的抗免疫排斥治疗，容易继发感染死亡，从而限制了其在临床上推广使用。所以明确PF发病机制，寻找靶向治疗PF的药物显得十分重要。

Toll样 受 体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是TLRs家族中的一个关键成员，是与炎症反应密切相关的蛋白质分子，而核转录因子κB（NF-κB）是位于Toll样受体家族下游的核转录因子，可调控白细胞介素（IL-6）、转化生长因子（TGF）-β1等多种基因参与炎症反应及增殖凋亡等过程，两者协同，当有炎症等刺激后，机体会通过上调TLR4的表达而激活NF-κB通路，促进下游的炎性因子如IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α的释放［2］，从而导致肺部炎症反应和肺纤维化发生。紫檀芪是存在于紫檀、葡萄、蓝莓等植物的酚类化合物，具有预防氧化应激反应、抗肿瘤、抗炎等多种药理活性［3］。我们前期研究提示紫檀芪可能通过调控NF-κB/TGF-β1信号转导蛋白来减轻博来霉素导致的大鼠肺纤维化程度［4］。紫檀芪能否通过激活TLR4/NF-κB信号通路来缓解炎症和氧化应激损伤作用、从而抗肺纤维化等未见报道，故本研究基于TLR4/NF-κB信号通路进一步从炎症、氧化应激等方面探讨紫檀芪对肺纤维化的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料SPF级健康雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，每只体质量200～250 g。紫 檀 芪（pterostilbene，PET；分子 式C16H16O3，上海哈灵生物科技有限公司），强的松片（浙江仙居制药股份有限公司生产）；BCA蛋白质浓度测定试剂盒（ASPEN公司），谷胱甘肽（GSH）、羟脯氨酸（HYP）、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（南京建成公司），ECL化学发光检测试剂盒（ASPEN公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备、分组与给药方法 所有大鼠适应性喂养1周后，将大鼠随机分为正常对照组（A组）、模型组（B组）及强的松组（C组）、紫檀芪组（D组），每组10只。除正常对照组（正常组）外，其余3组大鼠参照Szapiel等［5］经典造模方法诱导PF大鼠模型：1%戊巴比妥钠溶液按40 mg/kg注射麻醉大鼠后仰卧固定于鼠台上，消毒暴露气管，向气管内快速注入博来霉素（BLM，5 mg/kg）诱导肺纤维化模型，待大鼠自然苏醒后自由进食和饮水。于造模后第2天开始进行灌胃给药，根据预试验结果，正常对照组和模型组予以DMSO溶剂10 mL/（kg·d），强的松组予以强的松混悬液3.0 mg/（kg·d），紫檀芪组以30 mg/（kg·d）给药，连续3周。

1.2.2 病理学观察 取各组大鼠左肺用10%的中性甲醛固定，常规制备肺组织石蜡切片，Masson染色，光镜下观察肺组织病理学改变。

1.2.3 肺组织HYP、GSH、T-AOC测定 取右下肺组织于-80℃冰箱保存，采用比色法测定大鼠T-AOC，采用二硫代二硝基苯甲酸法测定大鼠GSH水平，采用碱水解法进行实验计算出单位重量肺组织HYP的含量。

1.2.4 肺组织TNF-α、IL-1β、iNOS测定 免疫组化法（IHC）检测，各组大鼠肺组织石蜡切片常规脱蜡，微波修复，冲洗封闭，去除BSA液，每张切片加入约50μL稀释的一抗TNF-α（1∶100）、IL-1β（1∶50）、iNOS（1∶300）覆盖组织，4℃过夜。PBS缓冲液洗涤，加二抗（1∶200），洗涤，DAB显色，封片，采用Image Pro Plus软件计算累积光密度值（IOD）值。

1.2.5 肺组织TLR4、NF-κB p65的蛋白表达水平 采用Western Blot法检测各组大鼠TLR4、NFκB p65蛋白表达量，使用软件分析蛋白条带灰度值。内参蛋白是GAPDH。

1.2.6 RT-PCR检测肺组织TLR4、NF-κB p65的mRNA表达水平 取大鼠右上肺组织20 mg，于1 mL预冷的TRIpure中充分研磨，离心，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA，配制qRT-PCR反应体系，引物序列见表1。根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书的方法检测基因表达水平，通过2-△△Ct法进行计算mRNA表达量。

表1 q RT-PCR引物序列

1.3 统计学方法所有数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间的比较采用t检验，多组间比较行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫檀芪对大鼠肺组织病理学变化的影响通过Masson染色我们可以发现，正常对照组可见支气管和肺泡结构正常，肺间质未见炎性细胞浸润、胶原沉积及纤维组织增生；模型组见肺组织中有较多的片状实变区，局部肺泡结构紊乱，肺泡壁增厚，肺泡间隔有炎细胞浸润及胶原沉积；紫檀芪组及强的松组肺泡炎及肺纤维化程度和范围介于正常对照组和模型组之间。见图1。

图1 各组大鼠肺组织Masson染色观察(Masson×200)

2.2 紫檀芪对肺纤维化大鼠肺组织中HYP、GSH、T-AOC的影响与正常对照组相比，模型组HYP含量明显升高；而经紫檀芪和强的松干预治疗后则较模型组有明显的降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与正常对照组相比，模型组肺组织GSH、T-AOC的表达下降（P＜0.01），紫檀芪组和强的松组GSH、T-AOC均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠HYP、GSH、T-AOC的比较(ˉx±s,n=10)

2.3 免疫组化检测TNF-α、IL-1β、iNOS蛋白水平结果发现，与正常对照组相比，模型组肺组织TNF-α、IL-1β、iNOS蛋白含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，紫檀芪组和强的松组肺组织TNF-α、IL-1β、iNOS蛋白含量明显减少（P＜0.01）。见图2、表3。

图2 各组大鼠IL-1β、iNOS、TNF-α蛋白表达（免疫组化×200）

表3 各组IL-1β、iNOS、TNF-α蛋白表达水平的比较(IOD;±s,n=10)

表3 各组IL-1β、iNOS、TNF-α蛋白表达水平的比较(IOD;±s,n=10)

与正常对照组比较,**P＜0.01；与模型组比较,##P＜0.01

组别正常对照组模型组强的松组紫檀芪组IL-1β 946.59±90.32 12 005.14±952.63**3 814.79±312.31##2 096.04±205.61##iNOS 520.44±55.86 10 276.18±829.64**4 447.40±801.78##1 766.00±69.51##TNF-α 1 586.49±133.39 17 733.01±3 001.90**3 920.35±283.85##2 392.72±453.26##

2.4 紫檀芪对肺纤维化大鼠肺组织TLR4、NFκB p65蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组TLR4、NF-κB p65磷酸化水平升高（P＜0.01）；但经紫檀芪及强的松治疗后，TLR4、NF-κB p65磷酸化水平下调，与模型组比较，差异均有显著性（P＜0.05）。见表4、图3。

表4 各组大鼠肺组织中TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达水平的比较(ˉx±s,n=10)

图3 各组大鼠肺组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达结果

2.5 RT-PCR检测TLR4、NF-κB p65的m RNA表达水平与正常对照组相比，模型组肺组织中TLR4、NF-κB p65 mRNA均升高（P＜0.01）；紫檀芪组及强的松组TLR4、NF-κB p65 mRNA均低于模型组（P＜0.01）。见图4。

图4 各组大鼠肺组织中TLR4、NF-κB p65 mRNA的比较

3 讨论

肺纤维化表现为肺组织慢性炎症和纤维化，博来霉素诱导大鼠肺纤维化在病理组织学改变及肺功能等方面与人肺纤维化最为相近，是目前应用最为广泛的动物模型［6］。本课题组大鼠肺纤维化造模已非常成熟，气管内注入盐酸博来霉素可导致大量的胶原纤维在支气管和肺门附近沉积，病理结果显示各给药组肺组织胶原沉积程度和范围明显减小，肺纤维化程度显著减轻，提示紫檀芪有一定改善大鼠肺纤维化症状的作用。肺纤维化的特征表现为细胞外基质在肺组织内过多沉积，分泌大量胶原蛋白成分，肺间质胶原明显增加，而羟脯氨酸为胶原纤维所特有，HYP含量测定可反映肺组织中胶原含量的变化，是肺纤维化程度的重要标志。本实验中模型组肺组织HYP的含量大幅上升，而紫檀芪组HYP含量显著降低，表明紫檀芪对肺纤维化进程中HYP的产生具有抑制作用，改善胶原蛋白的积聚，减轻肺纤维化。

TLR4是一种膜识别受体，通过激活NF-κB通路及诱导细胞因子、趋化因子和炎症介质的表达，在细胞的信号转导、自噬的发生、炎症反应的调节等方面有重要作用［7］。TLR4信号转导途径可启动下游的NF-κB通路，从而刺激机体释放炎症因子。NF-κB在体内参与了各种促炎因子、趋化因子等相关下游因子的转录和调控，在炎症和纤维化中发挥重要作用，因此阻断NF-κB转录活性可能是治疗炎症性疾病的重要靶点［8］。在生理状况下NF-κB与IκB结合处于被抑制状态，TLR4被激活后，通过一系列级联反应激活上游抑制蛋白IκB等，使其磷酸化降解，继而激活NF-κB p65由细胞质移位至细胞核，与靶序列和促炎基因的启动子结合，通过上调或下调各种参与炎症反应过程的介质，例如NO、TNF-α、IL-1β、iNOS等的释放，来影响炎症的发生发展［9］。iNOS是炎症免疫反应主要的限速酶［10］，炎性因子和氧化应激等刺激下活化的iNOS可产生大量的NO，加剧组织损伤；NF-κB信号通路是炎症信号转导途径中的主要通路之一，NF-κB的活化可进一步激活iNOS等，使炎症反应得以级联放大。TNF-α是具有促炎作用的关键炎性因子，其基因转录启动区或增强子上有NF-κB的结合位点，主要通过NF-κB途径发挥作用，两者相互促进，共同调控肺纤维化的发展［11］。本次研究中，与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、iNOS、TLR4和NF-κB p65的磷酸化水平明显增加（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，紫檀芪组大鼠肺组织中TLR4和NF-κB p65的蛋白和mRNA表达水平明显下调，紫檀芪能显著降低模型大鼠肺组织IL-1β、TNF-α、iNOS等炎症因子分泌水平，表明紫檀芪可能在肺纤维化的炎症反应中起着重要的调节作用，能减轻肺纤维化的炎症反应。

氧化应激在肺纤维化发生发展中越来越受到重视，细胞因子如TNF-α、IL-4、IL-10、IL-1β等与氧化应激损伤有关，可调节氧化/抗氧化系统之间平衡，减少氧化应激损伤［12］。气管内注入的博来霉素可产生活性氧致肺泡上皮细胞和血管内皮细胞受损，破坏机体氧化应激水平，如体内重要的抗氧化剂GSH和T-AOC水平会大幅下降（GSH、T-AOC水平反映了人体清除自由基的抗氧化能力）。本次研究发现，模型组与正常对照组相比，氧化应激指标GSH、T-AOC降低，经过紫檀芪干预后，GSH、TAOC水平有明显升高，表明紫檀芪能提高肺纤维化大鼠的抗氧化能力，降低氧化损伤。

综上所述，紫檀芪可能通过阻断TLR4/NF-κB信号通路进而抑制炎症因子表达，改善氧化应激水平，减轻肺组织损伤和肺纤维化进程，该结果为紫檀芪作为肺纤维化的潜在治疗药物提供了新的证据。