血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂LCZ696通过上调心房利钠肽改善心肌病大鼠的心功能

王庆义 刘洪智 高传玉 原 芳 徐 予 田 焕 刘 琳 安松涛 张 优 王素琴张鹏飞 石亚楠 魏晶晶

1河南省人民医院/郑州大学人民医院心功能科 河南 郑州 450003；河南省人民医院/郑州大学人民医院/阜外华中医院2心血管内科，3超声科 河南 郑州 451464

阿霉素是临床上常用的高效蒽醌类抗肿瘤药物，长期使用阿霉素治疗最严重的副作用是伴有充血性心力衰竭的扩张型心肌病，预后极差，从而限制了其临床应用。导致阿霉素心肌病的机制非常复杂，包括氧化应激、脂质过氧化、线粒体功能障碍、钙超载等，但是基于这些机制给予相应的治疗仍未获得更好的治疗效果［1］。有研究表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）参与阿霉素心肌病左室重构和心 力 衰 竭 的 发 生 发 展［2］。脑 啡 肽 酶（neprilysin，NEP）属于一种广谱中性肽链内切酶，利钠肽系统及血管紧张素Ⅱ等肽类可通过其降解。脑啡肽酶抑制剂可增加利钠肽水平，与血管紧张素受体抑制剂（angiotensin receptor blockers，ARBs）类药物联合，即可上调有益心衰的利钠肽系统，又可拮抗不利心衰的RAAS系统［3］。首种血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂（angiotensin receptor neprilysin inhibitor，ARNI）类药物LCZ696沙库巴曲/缬沙坦（Entresto，诺欣妥），是一种由脑啡肽酶抑制剂前体药物AHU 377（即沙库巴曲和缬沙坦）组成的单分子药物。其能否通过上调心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）改善阿霉素心肌病心力衰竭左室重构及心功能，目前尚无研究。本研究目的是探讨LCZ696能否通过上调ANP从而防止阿霉素心肌病大鼠心肌纤维化和心功能不全。

1 材料与方法

1.1 实验材料Wistar大鼠［成年雄性，SPF级，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0010］；盐酸阿霉素（CAS#25316-40-9，源叶生物）；LCZ696（诺华公司馈赠）；大鼠心钠肽（ANP）试剂盒（MM-21097R1）；大鼠环磷酸鸟苷（cGMP）试剂盒（MM-0027R1）；大鼠N端前脑钠素（NT-proBNP）试剂盒（MM-0329R1）；改良Masson三色染色液（G1345，Solarbio）。

1.2 阿霉素心肌病模型建立及给药处理选取34只健康雄性Wistar大鼠，体质量300～350 g，所有动物于动物实验室适应性饲养7 d后，分3组：（1）模型组（n=12），注射用盐酸阿霉素2.5 mg/kg，腹腔注射，每周1次，连续6周；（2）阿霉素心肌病模型+ARNI类药物LCZ696治疗组（LCZ696治疗组，n=12），阿霉素给药方法同模型组，在首次注射阿霉素前1周开始给予LCZ696治疗，按照60 mg/（kg·d）剂量灌胃，持续7周；（3）正常对照组（n=10），用相同容量的生理盐水代替阿霉素，给药方法同模型组。试验第7周，利用超声心动图测量大鼠左室结构和功能，然后处死动物，留取外周血和左室心肌组织标本，一部分多聚甲醛固定，蜡块包埋，一部分置于-80℃冷冻保存，以检测其它指标。

1.3 超声心动图检测心脏结构及功能3组大鼠分别于注射完成1周后（第7周），20%乌拉坦麻醉，进行经胸高频超声心动图（美国Visualsonics公司vevo2100彩色超声显像仪）检查，探头频率为15 MHz。在二维切面上显示胸骨旁左心长轴观，然后采用M型超声心动图方法分别测量各组大鼠的左心室舒张内径（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短轴 缩 短 分 数（left ventricular fraction shortening，LVFS），所有的参数均取3次测量后的平均值。

1.4 ELISA检测大鼠血浆ANP、cGMP和NTproBNP的浓度采用双抗夹心法，分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中加样品50μL，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。温育：用封板膜封板后置37℃温育60 min。配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min。终止：每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD）值。测定应在加终止液后15 min以内进行。

1.5 左室心肌Masson染色心肌组织固定于4%多聚甲醛固定液中，常规脱水包埋。切片厚4μm，常规脱蜡至水。切片入Bouin液，置于37℃的温箱内24 h进行媒染，然后流水冲洗至切片上的黄色消失，天青石蓝染液滴染3 min，稍水洗。酸性乙醇分化液分化数秒，流水冲洗10 min。丽春红品红染色滴染10 min，水洗。磷钼酸溶液处理10 min，弃液，直接滴入苯胺蓝染色液染5 min。弱酸处理2 min，95%的乙醇快速脱水3次。二甲苯透明3次，每次2 min。中性树脂封固，镜下观察切片。采用图像分析系统，通过灰度调节区别胶原和非胶原成分，测量心肌组织胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)，CVF=胶原纤维染色面积/总面积×100%，每张切片均随机取5个视野测量，计算其均值。

1.6 荧光定量RT-PCR（RT-qRCR）取左室心肌组织样本经液氮研磨成粉末，加入TRIzol裂解液后再次研磨，收集组织匀浆液以提取总RNA。利用紫外可见分光光度计测定RNA的浓度和纯度（OD260/OD280）。将RNA通过逆转录HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA。利用荧光PCR仪进行荧光定量PCR。引物序列由通用生物系统（安徽）有限公司合成（表1）。β-actin作为内参，TGF-β的相对表达量根据2-△△Ct法计算。

表1 引物序列及产物长度

1.7 统计学分析所有数据均用SPSS 21.0进行统计分析，计数资料采用卡方检验，计量资料表示为均数±标准差。正态分布的连续变量进行比较采用One-way ANOVA分析，两两比较采用Tukey方法，对于非正态分布及方差不齐的数据采用Kruskal-Wallis非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 死亡率正常对照组大鼠全部存活；模型组5只大鼠死亡，死亡率为41.7%；LCZ696治疗组2只大鼠死亡，死亡率为16.7%，死因主要为慢性心力衰竭，三组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 超声心动图结果与正常对照组相比，模型组大鼠的LVEF和LVFS均显著降低，而LVEDD和LVESD均显著升高（P＜0.05）；而与模型组相比，LCZ696治疗组大鼠的LVEF和LVFS显著升高，而LVEDD和LVESD均显著降低（P＜0.05），表明LCZ696可改善阿霉素心肌病心力衰竭大鼠心功能，结果如表2所示。

表2 各组大鼠超声心动图结果

2.3 LCZ696对大鼠左室心肌纤维化的影响Masson染色结果显示正常对照组大鼠仅有少量胶原纤维存在于血管周围和心肌细胞之间，而模型组大鼠左室心肌间质胶原纤维增多明显，紊乱排列，坏死的肌纤维被蓝色的胶原纤维取代，胶原容积分数明显升高（P＜0.05）。ARNI类药物LCZ696治疗组与模型组相比，纤维化明显减轻，胶原容积分数明显降低（P＜0.05），见图1。

图1 Masson染色观察大鼠心肌组织纤维化情况（×100）

2.4 LCZ696对阿霉素心肌病心力衰竭大鼠血浆ANP、cGMP和NT-proBNP的影响 通过ELISA方法检测各组大鼠血浆中ANP、cGMP和NTproBNP的浓度，结果如图2所示。与正常对照组相比，模型组中ANP、cGMP、和NT-proBNP升高（P＜0.05）；而LCZ696治疗组与模型组相比，NTproBNP显著降低（P＜0.05），而ANP和cGMP进一步升高，具有显著性差异（P＜0.05）。

图2 ELISA检测血浆中ANP、NT-pr oBNP和cGM P浓度

2.5 LCZ696对模型组大鼠心肌组织中TGF-β表达的影响结果如图3所示。与正常对照组相比，模型组中TGF-β的mRNA水平显著上调（P＜0.05）；与模型组相比，ARNI类药物LCZ696治疗组TGF-βmRNA水平显著下调（P＜0.05）。

图3 ARNI类药物对阿霉素心肌病大鼠心肌组织中TGF-βm RNA表达的影响

3 讨论

阿霉素是临床上常用的肿瘤化疗药物，长期使用阿霉素治疗最严重的副作用是伴有充血性心力衰竭的扩张型心肌病［1］。本研究结果显示，阿霉素诱导的心肌病心力衰竭模型组大鼠心肌间质胶原纤维增多明显，紊乱排列，左室心肌中心肌纤维化相关的TGF-β表达升高；超声心动图也显示左室扩大，左心收缩功能明显下降，心衰标记物NT-proBNP明显升高，提示阿霉素心肌病心力衰竭模型组存在明显的心肌纤维化和收缩功能减退。

LCZ696是诺华公司研发的首种血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂。Burke等［4］研究发现LCZ696与单用缬沙坦相比，可明显抑制腹主动脉缩窄小鼠心衰模型心肌纤维化及心功能减退，与ANP/NPRA/cGMP通路上调从而RhoA磷酸化失活抑制心脏成纤维细胞增殖激活有关。Maslov等［5］研究发现LCZ696可改善主动脉瓣关闭不全导致的容量超负荷心力衰竭大鼠模型心功能及活动耐量，降低心肌纤维化，这一保护作用与ARB拮抗血管紧张素Ⅱ以及抑制脑啡肽酶导致血浆中ANP升高之间的协同作用有关。PROVE-HF研究亚组入选144例慢性收缩性心力衰竭患者，发现LCZ696治疗后，外周血中ANP升高近2～4倍，血或尿中cGMP水平明显升高，心功能明显改善，且发现治疗早期ANP升高越多，其长期治疗左室逆重构作用越显著［6］。综合上述研究，ARNI心衰治疗获益主要机制除了与抑制RAAS以外，还与抑制脑啡肽酶，从而使得利钠肽系统尤其是ANP升高为主，ANP可通过利钠肽A型受体（natriuretic peptide type A receptors，NPR-A），激活鸟苷酸环化酶（guanylate cyclases，GC），使得细胞内第二信使（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）升高，进一步激活蛋白激酶G（protein kinase G，PKG），发挥利尿利钠、外周血管扩张、拮抗RAAS、抗心肌纤维化等保护作用。本研究利用阿霉素心肌病心力衰竭大鼠模型，发现LCZ696治疗组大鼠较模型组大鼠外周血中心衰标记物NT-proBNP明显下降，而外周血中ANP及cGMP浓度进一步升高，左室射血分数和左室短轴缩短率较心衰模型组明显改善，并且左室内径明显降低，心肌间质纤维化明显改善，左室心肌中心肌纤维化相关的TGF-β表达降低，表明LCZ696可明显改善阿霉素心肌病心力衰竭大鼠左室心肌纤维化及心功能，这种获益可能与ANP和cGMP升高及抑制TGF-β表达有关。Miyagawa等［7］研究亦发现内皮素转换酶1基因敲除杂合子小鼠通过降低内皮素-1含量及升高ANP和cGMP含量，从而减轻阿霉素导致的心肌损伤及心功能减退。另外，有研究表明，LCZ696通过抑制Drp1介导的线粒体结构和功能障碍或通过抑制NF-κB介导的炎症反应或通过抑制基质金属蛋白酶活性从而减轻阿霉素心肌病左室心肌纤维化及改善心功能［8-10］。由此可见，LCZ696可逆转或防止阿霉素引起的心肌纤维化及心力衰竭，与我们的研究结果一致。

综上所述，在阿霉素导致的慢性心肌损伤和心肌病心力衰竭大鼠模型中，ARNI类药物LCZ696通过增加外周血中ANP和cGMP浓度及抑制左室心肌TGF-β表达，从而部分抑制阿霉素心肌病大鼠心肌纤维化、改善心功能。本研究为阐明ARNI类药物治疗心衰的作用机制及对阿霉素心脏毒性和心力衰竭的防治具有一定的意义。