基于网络药理学探讨薏苡仁汤治疗膝骨关节炎的作用机制

罗 靓,易天新,冷文飞

(1.重庆市中西医结合康复医院,重庆 400013；2.重庆市垫江县中医院,重庆 408300)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是临床常见的慢性退行性关节疾病,以关节疼痛、关节活动受限、晨僵、关节肿胀为主要临床特点,其发病机制复杂,通常认为与炎症、创伤、代谢、遗传、免疫反应等多种因素相关。目前临床治疗KOA主要通过口服抗炎止痛药、关节腔注射药物、康复理疗、手术等方法缓解疼痛,改善功能状态,但均存在一定的局限性。而中医药治疗KOA具有疗效显著、不良反应小等优势[1]。薏苡仁汤出自清·林珮琴《类证治裁》,由薏苡仁、苍术、羌活、麻黄、桂枝、独活、当归、川芎、防风、川乌、生姜、甘草12味中药组成,有祛风除湿、散寒通络止痛的功效。研究显示,薏苡仁汤能缓解KOA患者的疼痛症状,改善其膝关节功能,且安全性较好[2]。本研究运用网络药理学方法,将薏苡仁汤的活性化学成分及关键作用靶点筛选后进行聚类分析,构建“中药复方-成分-靶点-通路-疾病”网络,探讨其治疗KOA的有效药物成分和可能作用机制,为新药的研发和临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 薏苡仁汤有效活性成分筛选 利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php),分别以薏苡仁汤所含的12味中药作为Herb name,设置口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选条件检索有效活性成分[3]。

1.2 有效活性成分靶点预测 采用TCMSP数据库检索有效活性成分的靶点蛋白名称,并通过Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)转换为基因名。

1.3 KOA疾病相关靶点信息收集 将“knee osteoarthritis”作为关键词分别输入DisGeNET(http://www.disgenet.org/search)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中,检索KOA疾病靶点,分别设置Score≥0.3和Score≥10,删除重复基因。

1.4 疾病与药物共同靶点和核心活性成分筛选 运用Venny 2.1.0平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对薏苡仁汤有效活性成分靶点与KOA疾病相关靶点进行映射,获得共同靶点。将共同靶点和对应的中药活性成分输入Cytoscape 3.7.1进行关联,根据中介中心性(BC)对活性成分进行降序排列,筛选出核心活性成分。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络绘制 将药物与疾病的交集靶点基因输入STRING数据库(http://string-db.org)中,设置置信度≥0.4和“homo sapiens(人属)”为关键词,绘制PPI网络图,根据分析结果统计靶标蛋白关联频次。

1.6 基因富集分析 通过R软件Cluster Profile程序包(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)对筛选出的共同基因进行GO功能、KEGG通路富集分析后绘制柱状图、气泡图进行可视化处理。

1.7 中药复方-成分-靶点-通路-疾病网络构建 根据薏苡仁汤、有效活性成分、靶点、通路与KOA之间的关系,建立中药复方-成分-靶点-通路-疾病网络。采用Cytoscape 3.7.1进行可视化处理。

2 结果

(1)薏苡仁汤的有效活性成分筛选 收集薏苡仁汤12味中药中不同活性成分共168种,其中薏苡仁9种,苍术9种,羌活15种,独活9种,防风18种,川乌3种,麻黄23种,桂枝7种,当归2种,川芎7种,生姜5种,甘草92种。不同药物中含有共同的活性成分,这些成分在发挥作用时可能起到增效作用。见表1。

表1 薏苡仁汤的有效活性成分

续表

(2)药物靶点与疾病靶点的交集预测和核心活性成分筛选 利用Uniprot、TCMSP数据库筛选出有效活性成分不同的药物靶点212个,通过DisGeNET、GeneCards数据库检索到KOA疾病靶点198个,导入Venny 2.1.0进行映射后获得交集靶点28个。药物-疾病的交集靶点可认为是薏苡仁汤干预KOA的潜在基因靶点,见表2。将28个基因靶点与其对应的中药活性成分进行关联,根据BC对活性成分进行降序排列,筛选出主要核心活性成分为谷甾醇、甘露醇、汉黄芩素、柚皮素、花旗松素、槲皮素。

表2 薏苡仁汤干预膝骨关节炎的潜在基因靶点

(3)PPI网络图 将28个交集靶点导入STRING平台,设置置信度≥0.4和“homo sapiens(人属)”为关键词,构建PPI网络图(图1见正文第125页)。基于STRING平台构建共获得28个节点,296条边,平均Degree为21.2,其中节点表示靶标蛋白,每条边表示靶标蛋白之间的作用关系。按点度中心性值降序排列后对核心作用靶点进行筛选,得到的核心靶点前10位为白细胞介素-6(IL-6)、趋化因子配体2(CCL2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、白细胞介素-1B(IL-1B)、基质金属蛋白酶3(MMP-3)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)、纤连蛋白1(FN1)、趋化因子配体8(CXCL8)。

图1 薏苡仁汤治疗膝骨关节炎28个交集靶点PPI网络图

(4)GO功能和KEGG通路富集分析 通过R软件和Cluster Profile程序包,以P＜0.05为筛选条件,对薏苡仁汤治疗KOA的潜在靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。①GO功能富集分析:A.生物过程1 162个,主要涉及细胞外基质组织形成、细胞黏附调节、细胞外结构组织形成、神经炎性反应调节、炎性反应调节、白细胞迁移、急性期反应、细胞间黏附正调节等(图2见正文第125页)。B.细胞组分8个,包括细胞外基质胶原蛋白、内质网腔、纤维状胶原三聚体、带状胶原纤维、胶原三聚体、胶原三聚体复合物、细胞外基质成分、血小板α颗粒内腔(图3见正文第125页)。C.分子功能30个,包括细胞因子活性、受体配体活性、细胞因子受体结合、生长因子受体结合、整联蛋白结合、生长因子活性、金属内肽酶活性、细胞黏附分子结合、丝氨酸型内肽酶活性、细胞外基质结构组成等(图4见正文第125页)。②KEGG通路富集分析71条,取排名前20位进行分析,发现由高到低依次为糖基化终产物及其受体信号通路、类风湿关节炎、IL-17信号通路、阿米巴病、流体剪切应力、动脉粥样硬化等,用高级气泡图列举排名前20位的条目,气泡大小表示富集的通路条数,颜色表示P值大小(图5见正文第125页)。

图2 薏苡仁汤治疗膝骨关节炎GO功能生物过程分析

图3 薏苡仁汤治疗膝骨关节炎GO功能细胞组分分析

图4 薏苡仁汤治疗膝骨关节炎GO功能分子功能分析

图5 薏苡仁汤治疗膝骨关节炎KEGG通路富集高级气泡图

(5)构建中药复方-成分-靶点-通路-疾病网络 根据中药复方、成分、靶点、通路、疾病之间的关系,通过Cytoscape 3.7.1进行网络可视化。在导出的网络图(图6见正文第125页)中,用不同颜色节点表示活性成分、靶点、通路等,黄色菱形节点表示薏苡仁汤,红色菱形节点表示KEGG和KOA,粉红色圆形节点表示核心活性成分,蓝色正方形节点代表核心作用靶点,绿色六边形节点代表作用信号通路,各节点之间构成关系通过边连接。图中显示同一靶点对应多个作用通路和多个作用靶点对应同一通路的关系。

图6 薏苡仁汤治疗膝骨关节炎中药复方-成分-靶点-通路-疾病网络图

3 讨论

近年来KOA的发病率不断上升,但其病因尚不完全明确,可能与多种细胞因子调控和多基因表达有关[4]。KOA属于中医“痹证”范畴,《黄帝内经》言:“病在骨者,骨重不可举,骨髓酸痛,寒气至,名曰骨痹。”故寒湿型骨痹由于素体外感风寒湿邪,内外之邪痹阻经脉所致。薏苡仁汤有祛风除湿、散寒通络止痛的功效,其中薏苡仁、苍术健脾除湿,桂枝、川乌、麻黄温经散寒兼除湿,川芎、当归养血活血,防风、独活、羌活祛风胜湿,生姜温中散寒,甘草调和诸药。有研究表明,薏苡仁具有调节免疫功能、调整代谢紊乱的作用[5-6],麻黄具有抗炎、调节免疫的作用[7],防风可抗骨质疏松[8],独活、当归均可抗炎及保护软骨[9-10],羌活、川乌可抗炎镇痛[11-12],苍术、桂枝、川芎、生姜均有抗炎作用[13-16]。虽然现代研究对薏苡仁汤中各主要成分的药理作用研究较多,但对其治疗KOA的作用机制报道较少。

本文基于网络药理学方法,对薏苡仁汤治疗KOA的作用机制进行了初步研究,发现薏苡仁汤治疗KOA的核心成分为谷甾醇、甘露醇、汉黄芩素、柚皮素、花旗松素、槲皮素。有研究表明,血清胆固醇是骨关节炎(OA)进展的危险因素,在OA早期可观察到软骨内脂质沉积[17],谷甾醇有降低血清胆固醇的作用,从而延缓OA进程。汉黄芩素是一种类黄酮,通过抑制氧化应激、软骨细胞凋亡,增加软骨生成标记物的表达,抑制炎症介质表达以治疗OA[18]。有研究借助薄层色谱法验证了槲皮素与IL-6蛋白对接良好,对KOA发挥镇痛和抗炎作用[19]。然而,目前对于甘露醇、柚皮素、花旗松素治疗KOA的机制研究较少,尚需进一步研究验证。

通过分析PPI网络图发现,薏苡仁汤治疗KOA的核心蛋白包 括 IL-6、CCL2、MMP-9、VEGFA、MMP-2等。IL-6是一种促炎细胞因子,对于慢性炎性反应有重要意义,滑膜成纤维细胞分泌IL-6后,促炎性mRNA表达增加[20]。CCL2是一种高特异性趋化因子,机械刺激间充质细胞诱导CCL2募集经典单核细胞,这些细胞可以分化为吸收骨的破骨细胞,其遗传消融或对其细胞表面趋化因子受体2(CCR2)的药理靶向作用减轻了机械诱导的关节炎恶化[21]。VEGFA属于血小板衍生生长因子(PDGF)/VEGF生长因子家族,在关节炎症进展中参与了诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制凋亡等过程,而其剪接轴的变化与关节炎症相关[22]。MMP-2和MMP-9同属于明胶酶类,MMP-2在不同类型的关节炎中可促进细胞外基质降解,某些促炎细胞因子的释放也通过MMP-2激活来调节,导致进一步的组织破坏[23]。MMP-9多与关节软骨所受压应力所致关节软骨Ⅳ型胶原纤维降解有关[24]。

GO富集分析结果显示,薏苡仁汤治疗KOA与细胞外基质组织、细胞黏附调节、细胞外结构组织形成、神经炎性反应等生物合成与代谢过程有关。有研究表明,软骨细胞外基质的合成与降解之间平衡状态的维持是OA发生与否的关键因素[25]。细胞组分涉及细胞外基质胶原蛋白、内质网腔、纤维状胶原三聚体等,这些成分可能参与了细胞增殖与凋亡、炎性反应等过程。分子功能涵盖细胞因子活性、受体配体活性、细胞因子受体结合、生长因子受体结合、整联蛋白结合等。薏苡仁汤治疗KOA的KEGG信号通路多与调节免疫和抗炎有关,主要有糖基化终产物及其受体信号通路、类风湿关节炎、IL-17信号通路等,而糖基化终产物及其受体信号通路多与糖尿病相关疾病有关,作用于KOA的报道较少,或可成为新的探索思路。

综上所述,薏苡仁汤可通过多成分、多靶点、多途径发挥对KOA的治疗作用,为后续的药物研发和临床治疗提供了新的方向。

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