复方斑蝥胶囊辅助治疗对胃癌患者临床疗效及外周血NLRP3炎性小体表达的影响*

王亚玲，王昌明△，李 晓

1 彭州市人民医院，四川 彭州 611930；2 成都医学院第一附属医院肿瘤科

目前，胃癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，化疗作为其主要的治疗手段，在临床得到了广泛运用，但因其存在较为严重的不良反应，部分患者依从性较差［1］。在化疗药物基础上，给予中医药辅助治疗恶性肿瘤，显示出了较好的临床疗效。胃癌患者多气虚无力，血脉瘀滞，根据中医“久病多瘀”理论认为益气化瘀是治疗胃癌的关键［2］。复方斑蝥胶囊临床广泛运用于肺癌、乳腺癌等疾病的辅助治疗［3-4］，但其机制尚不完全清楚。近年来，已有研究表明肿瘤作为一类炎症性疾病，炎症反应的激活与肿瘤的发生及进展密切相关，肿瘤的免疫防治作为重要的治疗手段而备受关注［5］。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎性小体是免疫炎症反应的重要组成部分，参与了恶性肿瘤的发生、发展过程，因此抑制NLRP3激活是肿瘤治疗的重要方向［6］。本研究通过观察复方斑蝥胶囊辅助治疗对胃癌患者NLRP3炎性小体表达的影响，为探讨其作用机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料将2017年8月至2019年8月于彭州市人民医院就诊的胃癌患者110例按随机数字表法分为对照组和观察组各55例。两组患者性别、年龄、TNM分期等比较差异无统计学意义（P＞0.05）。研究获得了本院伦理委员会的批准。

1.2 纳入标准1）有明确的病理学确诊；2）未接受过放、化疗及相关手术治疗；3）知情同意。

1.3 排除标准1）各种急、慢性感染及合并自身免疫性疾病者；2）近期使用过激素、免疫抑制剂者；其他部位恶性肿瘤者；3）对复方斑蝥胶囊过敏者。

1.4 设备与试剂荧光定量PCR仪（美国Biorad公司）；人淋巴细胞分离液（美国Sigma公司）；逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒（Takara公司）；人血清白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（中国武汉博士德公司）；抗NLRP3、Caspase-1及GAPDH单克隆抗体（美国Santa公司）。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组 采用FOLFOX4方案进行化疗：奥沙利铂甘露醇注射液（江苏恒瑞医药公司；国药准字H20050962；规格：100 mL∶奥沙利铂0.1 g+甘露醇5.0 g）85 mg/m2，静脉滴注，每日2 h，第1天；注射用亚叶酸钙（哈尔滨三联药业公司；国药准字H20034073；规格：200 mg）200 mg/m2，静脉滴注，第1～2天；氟尿嘧啶（上海旭东海普药业公司；国药准字H31020593；规格：10 mL∶氟尿嘧啶0.25 g）400 mg/m2，静脉滴注0.75 g，第1～2天，此后微量泵入（5 mL/h），共计44 h。以14天为1个治疗周期，连续用药4周期后评估疗效。

1.5.2 观察组 在对照组治疗的基础上加用复方斑蝥胶囊（贵州益佰制药公司；国药准字Z52020238；规格：0.25 g）每次3粒，每日2次，以14天为1个治疗周期，共治疗4个周期。

1.6 观察指标

1.6.1 标本采集与处理 抽取胃癌患者治疗前后静脉血4 mL，置于肝素抗凝管中，加入等体积人淋巴细胞分离液，经离心半径15 cm，2991 r/min离心15 min后，得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。

1.6.2 炎性小体NLRP3及Caspase-1 mRNA水平qRT-PCR法检测 运用Trizol法提取外周血PBMC总RNA，测定RNA浓度，然后按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。依据TaKaRa公司提供的荧光定量PCR试剂盒说明书建立20μL反应体系，反应条件：预变性，95℃120 s，95℃5 s，60℃30 s，40个循环；溶解曲线：95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。结果分析：以GAPDH为内参，计算各组相应基因的△△CT值。以目的基因的量为定量结果进行统计学分析。

1.6.3 PBMCs中的NLRP3、Caspase-1的蛋白表达水平免疫印迹法检测 提取两组患者治疗前后人PBMCs总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取50μg蛋白于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至硝基纤维素膜，给予5%脱脂牛奶封闭2 h，分别孵育抗NLRP3抗体（1∶400）、Caspase-1抗体（1∶400）及抗GAPDH抗体（1∶500），4℃避光孵育过夜。次日取出膜，给予避光室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10000），采用凝胶成像系统测定蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的条带与GAPDH灰度比值。

1.6.4 IL-1β、IL-18水平检测 采用ELISA法测定外周血上清液IL-1β和IL-18水平。

1.6.5 临床疗效及不良反应 根据实体肿瘤治疗评价标准，临床疗效分为完全缓解、部分缓解、稳定及进展，总有效率为完全缓解+部分缓解；根据患者临床状态、生活自理程度、精神状态等，参照Karnofsky评分标准进行评分，总分100分，10分1个等级，得分越高，健康状况越好。根据WHO抗癌药物急性及亚急性毒性反应分级标准，以治疗结束时较治疗前评分提高10分以上为改善；评分不超过10分为稳定；评分低于10分以上为无效。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件分析数据，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达两组患者治疗后外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达均低于治疗前（P＜0.05），观察组低于对照组（P＜0.05），见图1及表1。

表1 两组患者治疗前后外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA水平比较（±s）

表1 两组患者治疗前后外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA水平比较（±s）

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别对照组观察组例数55 55时间治疗前治疗后治疗前NLRP3 mRNA 1.12±0.20 0.73±0.19*1.09±0.15*#Caspase-1 mRNA 1.06±0.18 0.77±0.14*1.10±0.16*#治疗后0.54±0.17 0.60±0.12

图1 两组患者治疗前后PBMCs中的NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平

2.2 IL-1β和IL-18水平与治疗前比较，两组患者治疗后外周血IL-1β和IL-18水平均降低（P＜0.05），观察组低于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 两组患者治疗前后IL-1β和IL-18水平比较（±s）pg/mL

表2 两组患者治疗前后IL-1β和IL-18水平比较（±s）pg/mL

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别对照组观察组例数55 55时间治疗前治疗后治疗前治疗后IL-1β 21.14±4.26 16.23±3.45*20.59±5.12 12.50±4.14*#IL-18 31.26±5.14 23.74±5.05*32.10±6.12 16.62±4.19*#

2.3 临床疗效总有效率观察组为74.55%，高于对照组的61.82%，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组患者临床疗效比较［n（%）］

2.4 Karnofsky评分疗效治疗后两组患者Karnofsky评分疗效比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 两组患者治疗后Karnofsky评分疗效比较［n（%）］

2.5 不良反应两组患者骨髓抑制、消化道症状、肝功能损伤、口腔黏膜炎症等发生率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

中医理论认为，气虚无力、血脉瘀滞是胃癌的重要病因，故益气扶正、化瘀解毒是治疗胃癌的关键［2］。复方斑蝥胶囊主要成分包括斑蝥、刺五加、女贞子、黄芪、三棱等，具有提高机体免疫力，诱发肿瘤细胞凋亡的作用［7］。胃癌的发病机制复杂，炎症信号通路的激活是其重要机制之一，抑制炎症信号通路的激活是胃癌治疗的重要方向。NLRP3炎性小体是炎症的启动点，通常情况下，机体NLRP3活性处于抑制状态，当NLRP3受外在刺激被激活时，可进一步激活下游Caspase-1，随后导致炎性因子IL-1β和IL-18水平升高，产生炎症级联反应［8］。有研究显示，NLRP3炎性小体在胃癌患者中呈高表达［9］，复方斑蝥胶囊对胃癌患者NLRP3炎性小体表达的影响，目前研究尚未阐明。

免疫逃逸是肿瘤发生、发展的重要机制之一，其中，炎症通路的激活，参与了肿瘤的免疫逃逸［10］。目前，已知存在五种炎性小体，其中NLRP3炎性小体研究较多，其结构和功能最明确。相关研究显示，NLRP3可促进炎症性疾病如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病肾病及动脉粥样硬化等疾病的进展，其可作为影响患者病情严重程度及预后的独立危险因素，同时也是炎症性疾病潜在的治疗靶点［11-13］。有研究显示，在肿瘤动物模型及肿瘤患者组织中均检测出高表达的NLRP3炎性小体，其可激活下游炎性细胞因子，促进肿瘤血管新生，降低NLRP3炎性小体表达可抑制肿瘤血管新生，改善肿瘤患者预后［14］。本研究在常规治疗的基础上加用复方斑蝥胶囊辅助治疗胃癌可提高临床疗效。以往研究显示，炎症可促进细胞焦亡，而细胞焦亡是引起组织器官功能障碍的主要机制之一，在细胞焦亡通路中，Caspase-1是重要的剪切酶，其作为NLRP3炎性小体的下游，在肿瘤组织中的表达显著升高，可能进一步参与肿瘤的进展［15］。本研究结果显示，复方斑蝥胶囊可降低胃癌患者NLRP3炎性小体及下游相关炎性通路的激活，其可能与改善患者临床症状及提高治疗效果相关。NLRP3炎性小体是机体炎症反应启动及持续放大的重要环节，相关研究显示，抑制NLRP3炎性小体的激活可降低机体炎症反应，改善炎症性疾病及相关恶性肿瘤患者临床疗效及预后［6，12］，而复方斑蝥胶囊可能通过降低NLRP3炎性小体水平抑制炎性通路激活，提高临床疗效。

综上所述，复方斑蝥胶囊可降低胃癌患者NLRP3炎性小体表达水平，抑制下游炎性通路的激活，提高患者临床疗效。但本研究样本量偏少，同时复方斑蝥胶囊如何调控NLRP3炎性小体的机制还有待于进一步研究。