抗纤软肝颗粒对肝纤维化小鼠肠道黏膜通透性的影响*

徐 俊，戚 璐，许 杰，李 硕，程良斌

湖北中医药大学，湖北 武汉 430061

肝纤维化是肝细胞发生坏死或炎症刺激时肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。慢性肝病大部分伴有肝纤维化，其中25%～40%最终发展为肝硬化乃至肝癌［1］，导致肝功能衰竭，严重危害患者生命健康。抗纤软肝颗粒为湖北省中医院院内制剂，是我院张赤志教授在已故名老中医吕继端教授临床经验基础上创立，由丹参、鳖甲、莪术、牡蛎、山楂、海藻、地骷髅组成，自20世纪80年代开始用于临床，至今30余年。前期研究表明［2-7］，抗纤软肝颗粒具有抗炎保肝、抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）增殖与活化、拮抗细胞因子、抗氧化应激、降低细胞外基质的累积和促进细胞外基质降解的作用。本实验在前期研究基础上，立足肠道微环境，观察抗纤软肝颗粒对CCl4诱导的肝纤维化小鼠肠道黏膜通透性及相关炎症因子表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级C57BL/6小鼠35只，购自湖北省动物中心，实验动物许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。

1.2 药物抗纤软肝颗粒由湖北省中医院药剂科提供（批准文号：Z20113145）。

1.3 试剂抗Claudin-1兔多克隆抗体（Ab15098，Abcam公司）；抗ZO-1兔多克隆抗体（21773-1-AP）、抗Occludin兔多克隆抗体（13409-1-AP）均由武汉三鹰生物技术公司提供；苏木素（AS1041）、伊红染液（AS1094）、铁苏木素液（AS1042）、丽春红染液（AS1022）均购自美国ASPEN公司；Trizol（15596-026）购自Ambion公司；引物合成由擎科生物公司完成，引物序列Occludin（83bp）Forward：5'-ATAGCCATTGTCCTGGGGTTCAT-3'，Reverse：5'-TCCATCTTTCTTCGGGTTTTCAC-3'；Claudin-1（109bp）Forward：5'-GAGACTACCACTGTCCCC-3'，Reverse：5'-AAAGAATCCTCAAAACCA-3'；ZO-1（101bp）Forward：5'-TGATCGTCTGTCCTACCTGTC-3'，Reverse：5'-CGCCTTCTGTATCTGTGTCTT-3'；GAPDH（253bp）Forward：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，Reverse：5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

1.4 仪器Milli-Q Advantage A10型纯水超纯水制备系统（Millipore公司）；CKX53型倒置生物显微镜（Olympus公司）；5418/5418R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；MuLtiskan MK3型酶标仪（Thermo Scientific公司）；SW-CJ-1FD型超净工作台（上海博讯公司）；Quant Studio 6型PCR仪（Applied Biosystems公司）。

1.5 实验动物造模与分组35只雄性C57BL/6小鼠，随机选取10只作为正常组，余下25只小鼠依照参考文献［8］方法，每日按2 mL/kg（体质量）皮下注射40%CCl4橄榄油溶液，每2天1次，持续8周，从25只模型组小鼠中筛选出20只成功模型，随机分为模型组与治疗组各10只。

1.6 动物干预方式与取材根据人与小鼠体表面积换算比进行计算［9］，治疗组抗纤软肝颗粒给药浓度为3.9 g/kg（体质量）；模型组灌胃等量生理盐水，每日1次，治疗时间为8周。用颈椎脱臼法处死全部小鼠，打开腹腔，采集肝左叶同一区域的肝组织样本，用4%多聚甲醛固定，用于形态学检测。同时采集小鼠升结肠部分结肠组织，生理盐水洗净后放入无菌EP管，用于RT-qPCR检测。

1.7 观察指标

1.7.1 肝组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法 将肝组织脱水，石蜡包埋，切片，切片脱蜡，用苏木精与伊红试剂染色，风干，封片，镜下观察。

1.7.2 肝组织Masson氏三色染色法 将肝组织切片脱蜡，苏木素试剂染核，流水冲洗，Masson丽春红染色，冰醋酸分化，1%磷钼酸水溶液分化，冰醋酸分化稍许，苯胺蓝染色，常规脱水，再封片，镜下观察。

1.7.3 免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）取结肠组织石蜡切片，常规脱蜡，行免疫组化染色：一抗40℃孵育过夜，二抗室温孵育60 min，随后苏木精复染细胞核，梯度酒精脱水后封片拍照，阳性反应为细胞胞浆中黄褐色沉淀。每张切片随机选取4个高倍视野应用Image J软件和GraphPad软件对阳性区域进行定量分析。

1.7.4 实时定量PCR法 100 mg组织样品用液氮充分研磨，加入1 mL Trizol，混匀，室温放置5 min充分裂解，加200μL氯仿，混匀使水相和有机相充分接触，4℃下离心半径13.5 cm，14 000 r/min离心15 min，吸取上清，加等体积异丙醇，混匀室温静置10 min，放-20℃冰箱过夜，次日4℃离心半径13.5 cm，14 000 r/min离心10 min，去上清，收集RNA沉淀，75°乙醇溶液洗涤2次，超净工作台风干沉淀，根据沉淀量加入DEPC水，溶解RNA。然后进行RNA反转录，铺96孔板，定量PCR，用相对定量2-△△t法分析结果。

1.8 统计学方法应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色正常组肝细胞形态完整，为规则圆形、椭圆形；模型组肝细胞脂肪变性严重，肝细胞呈不规则形状、点状坏死，炎性浸润严重，肝小叶结构不全，汇管区、肝小叶周边见蓝色纤维索状物；治疗组脂肪变性较模型组明显减轻，炎症反应减弱，肝损伤轻，肝小叶结构恢复较好。见图1。

图1 各组小鼠肝组织病理图（HE×100）

2.2 Masson染色正常组肝细胞排列整齐，肝小叶完整；模型组肝组织破坏，细胞脂肪变性，有点、灶状局部坏死和胶原沉积，肝索排列不均，假小叶形成；治疗组与模型组比较，肝组织损伤程度有所改善，脂肪空泡明显减少，纤维沉积程度减轻。见图2。

图2 各组小鼠肝组织病理图（Masson×100）

2.3 Occludin、Claudin-1及ZO-1表达与正常组相比，模型组小鼠结肠Occludin、Claudin-1、ZO-1表达降低（P＜0.05），治疗组结肠Occludin、Claudin-1、ZO-1表达相较模型组上调（P＜0.05）。见图3—4。

图3 各组小鼠结肠组织中Occludin、Claudin-1、ZO-1表达（×400）

图4 各小鼠结肠组织中Occludin、Claudin-1与ZO-1平均光密度

2.4 Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA表达模型组小鼠结肠Occludin、Claudin-1及ZO-1 mRNA表达 低 于 正 常 组（P＜0.05），治 疗 组Occludin、Claudin-1、ZO-1 mRNA表达较模型组上调（P＜0.05）。见图5。

图5 各组小鼠结肠组织中Occludin、Claudin-1与ZO-1的mRNA表达

3 讨论

研究表明［10-11］，肠道微环境是肝纤维化发病的机制之一，肠道菌群失调可引起肠道黏膜通透性增高，肠道细菌移位和肠源性内毒素血症，脂多糖及细菌相关代谢产物通过门静脉进入肝脏，引起肝细胞损伤、炎症因子释放、免疫功能紊乱和微循环障碍加重，从而加重肝纤维化。正常情况下，肠道具备完整的肠黏膜屏障系统，包括机械屏障、微生物屏障、化学屏障及免疫屏障，能有效阻挡肠道内细菌及其产物向肠外组织移位［12］。肠上皮细胞及其紧密联接是肠黏膜机械屏障的最重要的组成部分，其中紧密连接是极性上皮细胞顶端区的特异性膜区域，由多种跨膜蛋白和膜相关蛋白共同组成，主要包括Occludin、Claudin-1和ZO-1［13］。本研究中，经CCl4诱导后的肝纤维化小鼠结肠组织中Occludin、Claudin-1和ZO-1表达低于正常组，经抗纤软肝颗粒治疗8周后，相应蛋白表达量增高，同时肝脏组织HE染色和Masson染色显示小鼠肝纤维化程度较模型组减轻，表明小鼠结肠组织中Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的下调可能与肝纤维化病理学的改善具有相关性，抗纤软肝颗粒对小鼠肝纤维化的防治作用可能与调控肠道Occludin、Claudin-1和ZO-1表达有关。