益气活血方对心衰大鼠心肌细胞线粒体功能的影响及其机制探讨*

邢俊娥，吴 鹏，李海沅

广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530001

心力衰竭（简称“心衰”）是由多种原因导致心肌收缩和（或）舒张功能受损，引起心脏泵血功能障碍，是多种器质性心脏疾病的终末阶段，目前已成为心血管疾病的主要死亡原因［1-2］，《中国心血管病报告2016》指出，我国心衰患病率约为1%，约450万人［3］，且随着年龄增长发病率及病死率逐步提升［4-5］。目前认为心衰的病理生理机制为心室重构，心肌细胞凋亡又是心室重构的重要原因，心肌细胞能量代谢紊乱和凋亡已成为当前研究热点。线粒体为细胞能量代谢的主要器官，线粒体结构与功能改变可参与细胞凋亡，进而导致心肌代谢重构，引起慢性心衰［6］；同时在心力衰竭的发生发展过程中线粒体介导的心肌细胞凋亡发挥了重要作用［7］；因此在心力衰竭的治疗中，改善线粒体功能是其重要环节［8］。有关益气活血方的前期研究发现其对改善心肌细胞凋亡，治疗慢性心衰有独特优势［9］，本研究进一步从线粒体功能方面探讨益气活血方对心衰大鼠的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠90只，体质量（210±20）g，购于广西医科大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK桂2013-0005。所有大鼠饲养和实验均在广西中医药大学第一附属医院实验室进行，常温饲养，自由饮水，所食饲料均为标准合成大鼠饲料。

1.2 实验用药及主要试剂益气活血方（广西中医药大学第一附属医院中药房提供）。药物组成：党参15 g，黄芪15 g，麦冬10 g，五味子12 g，丹参15 g，赤芍15 g，川芎12 g，茯神10 g，炙甘草8 g等。将上述药物制成每毫升含生药1.52 g的溶液（80%的混悬液）。盐酸多柔比星粉针剂(阿霉素，浙江海正药业股份有限公司；国药准字H33021980；规格：10 mg/支）；依那普利片(石药集团欧意药业有限公司；国药准字H10980305；规格：10 mg/片)。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）和活性氧(reactive oxygen species,ROS)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1,南京凯基生物技术有限公司）。

1.3 仪器设备XMT-142型电热恒温培养箱（上海仪表有限公司）；转膜装置（美国Bio-Rad公司）；LG16-W型离心机（北京医用离心机厂）；Spectra Max L型微孔板检测系统（美国Molecular Devices公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及模型制备 大鼠饲养1周后随机取15只为正常组，剩余75只进行造模，制备阿霉素诱导的心衰模型，将阿霉素用生理水配制成2.0 mg/mL溶液，以1.5 mL/kg腹腔注射，每周注射1次，连续4周，并通过超声心动图检测造模是否成功。造模4周后将造模成功大鼠随机分为模型组、依那普利组及益气活血方低、中、高剂量组。

1.4.2 给药方法 按照大鼠体质量及体表面积法换算给药剂量。益气活血汤低、中、高剂量组分别予益气活血汤0.7、1.4、2.8 g/（kg·d）灌胃，依那普利组将依那普利片用蒸馏水配成混悬液［5.0 mg/（kg·d）］灌胃，正常组与模型组每天予等量生理盐水灌胃，各组均连续灌胃6周。

1.4.3 心功能检查 药物干预6周后将大鼠麻醉平卧位固定，并将心脏探头置于左心室长轴最大直径处标记室间隔与左室后壁收缩末和舒张末心内膜位置，自动计算左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室射血分数缩短(left ventricular fraction shortening，LVFS)、左心室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)，取3个心动周期求平均值；超声测量后处死大鼠收集新鲜心肌组织标本冰冻，待测。

1.4.4 ATP含量测定 给药6周后处死大鼠，取适量的心肌组织，裂解细胞，4℃离心半径30 cm，1.2×104 r/min离心12 min，取上清液。在96孔板中加入100μL ATP检测液，常温放置5 min左右，再加入50μL样品或标准品，迅速混匀，采用酶标仪测定相对光单位（relative light unit，RLU）值。

1.4.5 ROS水平测定 给药6周后处死大鼠，取适量的心肌组织，裂解细胞，采用10μmol/L DCFH-DA溶液重悬，37℃细胞继续培养20 min。每3～5 min颠倒一下，让探针与细胞充分接触。用培养基洗涤细胞3次，最后用200μL磷酸缓冲盐（PBS）进行重悬，采用荧光酶标仪测定ROS。

1.4.6 线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）测定 取新鲜心肌组织约100 mg，剪碎，加胰蛋白酶孵育，进行匀浆，离心后分离出线粒体，将新鲜配制的JC-1检测液加入到线粒体液体中，常温下避光，荧光分光光度计检测其荧光强度。提前设定好荧光酶标仪（22℃），荧光显微镜滤波器激发波长为490 nm，散发波长为590 nm（线粒体钙离子呈现红色）；激发波长为490 nm，散发波长为530 nm（线粒体钙离子呈现绿色）。

1.5 统计学方法采用SPSS 18.0软件分析数据，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 心功能与正常组比较，模型组LVEF、LVFS减低，LVEDD、LVESD增长（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组LVEF和LVFS升高（P＜0.05），LVEDD和LVESD缩短（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心脏超声参数比较（±s）

表1 各组大鼠心脏超声参数比较（±s）

注：与正常组比较，△表示P＜0.05；与模型组比较，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01；与依那普利组比较，▽表示P＞0.05

组别例数LVEDD（mm）LVESD（mm）LVFS（%）LVEF（%）正常组模型组益气活血方低剂量组益气活血方中剂量组益气活血方高剂量组依那普利组15 15 15 15 15 15 6.48±0.11 8.21±0.43△8.01±0.12 7.78±0.35 7.05±0.28▲▽7.09±0.45▲3.71±0.28 7.20±0.51△6.68±0.60 6.32±0.35 5.49±0.15▲▽5.38±0.74▲47.92±2.75 30.71±2.96△33.45±1.88▲36.52±2.56▲40.18±2.14▲▲▽41.22±1.61▲▲86.01±2.29 45.73±3.54△50.30±1.38▲55.82±2.91▲59.08±3.14▲▲▽58.21±2.95▲▲

2.2 心肌细胞中ATP、ROS及MMP水平与正常组比较，模型组ROS升高，ATP、MMP降低；与模型组比较，各给药组ROS下降，其中益气活血方中剂量组下降最明显（P＜0.05），而ATP水平和MMP升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），益气活血方高剂量组与依那普利组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心肌细胞中ATP、ROS及MMP水平（±s）

表2 各组大鼠心肌细胞中ATP、ROS及MMP水平（±s）

注：与正常组比较，△表示P＜0.05；与模型组比较，▲表示P＜0.05；与依那普利组比较，▽表示P＞0.05

组别正常组模型组益气活血方低剂量组益气活血方中剂量组益气活血方高剂量组依那普利组例数15 15 15 15 15 15 ATP（μmol/L）0.167±0.340 0.093±0.018△0.259±0.024△▲0.389±0.145△▲0.276±0.073△▲▽0.275±0.690△▲ROS（U/L）44.22±2.47 69.04±3.07△52.97±3.16△▲50.63±0.57△▲51.77±0.19△▲▽51.56±0.12△▲MMP（ng/mL）1.368±2.120 0.617±0.120△1.613±0.117△▲2.591±0.145△▲2.456±0.139△▽2.335±0.026△▲

3 讨论

心力衰竭是由于各种心脏病变和长期心脏负荷过重，导致心室肌收缩力下降不能满足机体代谢需要的一种疾病。心力衰竭属中医“心衰”“心悸”“脱征”范畴［10］。其病位主要在心，病理特点是本虚标实，以阳气虚衰为本，血虚、痰饮、水湿为标。益气活血方中党参补气，黄芪升发阳气为主药，辅助人参提升心阳；麦冬、五味子益气养阴生津；佐以赤芍、丹参、川芎活血通脉，茯神稳心定神。诸药配伍，具有益气养阴，活血化瘀，振奋心阳之功效。药理研究发现在心肌缺血疾病治疗方面黄芪甲苷等多种中药成份可能起重要作用［11］。黄芪总皂苷可抗心力衰竭，改善心肌供血，促进血管新生［12］。吴正国发现［13］常规治疗的基础上联用黄芪注射液可明显提高心力衰竭患者治疗的有效率并改善心功能。研究发现，三七、黄芪等中药具有清除氧自由基，抗氧化应激，抗动脉粥样硬化以及保护心脏细胞等作用［14-15］。人参能兴奋中枢神经，增加肾上腺皮质功能，抗疲劳；五味子和麦冬均能增强心肌收缩力，前者对呼吸有兴奋作用；后者可加速冠脉血流量和心脏输出量。有研究发现益气活血法可以激活心肌能量代谢通路，增加心肌细胞内线粒体浓度，提高线粒体功能，继而改善心肌细胞能量代谢［16-17］。同时应用活血益气中药可抑制心衰大鼠左室重构和心肌细胞凋亡［18］。

本研究提示各药物干预组LVEF和LVFS均提高，高剂量组和依那普利组与模型组LVEDD、LVESD水平降低；在正常氧化应激条件下，心肌细胞线粒体ROS生成显著增加，给予益气活血方干预后细胞内ATP水平及MMP升高，ROS含量降低。心肌正常的能量代谢是保证心脏舒缩功能和维持内环境稳定的物质基础，能量供应障碍可导致慢性心衰的发生，作为能量的供应场所线粒体功能下降在慢性心衰中起重要作用［19］，ATP和ROS是构成心肌细胞线粒体的主要能量物质，其中ATP直接提供能量，而ROS作用相反，ROS能导致心肌细胞氧化损伤，甚至引发细胞凋亡，线粒体功能是否正常对保证细胞机能起关键作用［20］，其结构和功能的异常可以导致心肌细胞供能减少，改变氧化还原系统［21］，而线粒体也是氧化应激的主要发生场所［22］，心力衰竭发生时脂肪酸的氧化分解下降并堆积在心肌细胞内，继发线粒体内膜上的解偶联蛋白（UCP）生成过多，线粒体通透性转换孔（MPTP）持续开放，加快ROS的生成，ROS通过降解线粒体内的蛋白质含量以及加快DNA结构破坏进而导致ATP的产生下降［23］。因此，慢性心衰后组织恢复氧灌注会引起剧烈的线粒体氧化应激，从而最终导致线粒体功能障碍，表现为MMP、ATP降低，ROS升高等。临床研究发现［24］应用中药制剂可降低心力衰竭大鼠线粒体跨膜电位下降的心肌细胞比例，增加心肌组织ATP合成能力。因此，氧化应激的预防被认为是减轻心衰导致心肌损伤的一种重要治疗策略［25］。

本研究结果显示，益气活血方可使细胞内ATP水平及MMP升高，ROS含量降低，说明益气活血方可通过抑制ROS的产生从而改善线粒体的能量代谢，保护心肌，减少心肌细胞的破损和凋亡，调控心室重构，延缓慢性心力衰竭的病程，但其具体作用机制还需进一步研究探讨。