姜黄素对重症手足口病模型大鼠的作用研究*

明是非，康秉南，程建敏

1.重庆市医科学校，重庆 400000； 2.石家庄医学高等专科学校，河北 石家庄 050000； 3.宿迁市第一人民医院，江苏 宿迁 223800

手足口病是一种肠道病毒引起手、足、口腔等全身多部位出现皮疹、疱疹或疱疹性咽峡炎的小儿急性传染病，该病多数可自愈，少数会发展为重症，最终导致残疾甚至死亡。由于手足口病传播途径广，隐性感染众多，且传播能力强，被我国列为丙类传染病[1]。目前，手足口病的治疗没有特效抗病毒药物，通常为对症治疗，患者可服用抗病毒药物，例如阿昔洛韦、干扰素、免疫球蛋白等[2]。此外，中医疗法在一定程度上对手足口病有疗效。中医认为，手足口病由湿邪和湿热蕴阻肌肤所致，需清热解毒、祛湿泻脾[3]。姜黄是植物姜黄的干燥根茎，味苦、辛，具有祛风除湿、清热解毒、通便利尿等功效[4]。姜黄素是姜黄的主要活性成分之一，具有抗病毒、抑菌抗炎等功效[5]。但是，姜黄素对肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)感染引起的重症手足口病是否也具有治疗作用尚未可知。D-二聚体(D-dimer，D-D)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)是重症手足口病早期诊断、治疗监测和疗效评定过程中的重要指标[6]。基于此，本研究探索姜黄素对重症手足口病模型大鼠的治疗作用及其对血浆D-D、NSE和NPY水平的影响，为姜黄素在重症手足口病临床治疗中的应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物与细胞62只7日龄无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雌雄各半SD大鼠，体质量9～16 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2018-0006。饲养温度18～26 ℃，相对湿度40%～60%，自由进食和进水，12 h光照/12 h黑暗交替，分笼饲养。该动物实验经重庆市医科学校实验动物伦理委员会审批通过，伦理批号：院准字202004-001。3T3鼠细胞(美国ATCC公司，货号：CCL-92)。

1.2 药物与试剂姜黄素(陕西建和生物技术有限公司，批号：1904152)；阿昔洛韦(上海梯希爱化成工业发展有限公司，批号：2019190810)；荧光染料预混剂(北京天根生化科技有限公司，货号：U10462513)；大鼠血浆D-D、NSE和NPY 检测试剂盒(上海纪宁实业有限公司，批号：190712、190916、191204)；核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取试剂盒(德国QIAGEN公司，货号：RT1031652PC)；反转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：QR3619104)；EV71BJ09/07(简称EV71 BJ)病毒引物及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物委托北京三博远志生物技术公司合成。

1.3 仪器MDF-U50V型超低温冰箱(日本SANYO公司)；GB303型电子天平(瑞士METTLER公司)；CFX96 Touch型实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)仪(美国Bio-Rad公司)；F50型酶标仪(瑞士Tecan公司)。

2 方法

2.1 动物分组、模型建立及给药从宿迁市第一人民医院临床重症手足口病患儿粪便样本中分离出25份可疑EV71样本，经过3次蚀斑纯化，3T3鼠细胞培养、传代，接种至2只7日龄SPF级SD乳鼠体内，得到可导致7日龄乳鼠死亡的EV71 BJ毒株。自60只7日龄SPF级SD大鼠中随机选出50只大鼠腹腔注射100 μL剂量为LD50的EV71 BJ建立重症手足口病大鼠模型，余下10只记为对照组。感染后第4日大鼠肌肉病毒载量达到峰值，大鼠出现精神萎靡、肢体颤动、共济失调、后肢瘫痪等表征，与手足口病重症患者临床表现较为吻合，因此判定感染后第4天重症手足口病大鼠建模成功。将建模成功大鼠随机分为模型组、阿昔洛韦组及姜黄素高、中、低剂量组。姜黄素高、中、低剂量组大鼠灌胃给予20 mg·kg-1、10 mg·kg-1、5 mg·kg-1的姜黄素，阿昔洛韦组灌胃6.6 mg·kg-1的阿昔洛韦，模型组和对照组灌胃等体积生理盐水，连续治疗2周。在治疗第1天、第4天、第7天、第10天、第13天记录大鼠体质量的变化。

2.2 RT-qPCR检测大鼠肌肉组织EV71 BJ病毒载量治疗2周后，颈椎脱臼处死大鼠，取大鼠右后肢肌肉组织20 mg，组织匀浆。使用RNA提取试剂盒提取组织中总RNA，反转录得到互补的脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，从美国国家生物信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)基因库中查找EV71 BJ病毒序列，设计出引物，上游引物：5′-TAGAAGCTAGGAATATCGAT-3′，下游引物：5′-ATGATCGCTAGATGGCTAGA-3′，产物长度为 201 bp。内参GAPDH上游引物：5′-TGAGCTGCCTAGAATGACTAG-3′，下游引物5′-TAGCCTAGGCTAGACTGAA-3′，产物长度119 bp。反应体系为：cDNA 0.5 μL，上下游引物各1 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)1 μL，荧光预染混合试剂1 μL，ddH2O 5.5 μL，总体系10 μL。反应流程：95 ℃ 30 s，95 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，共40个循环，最后60 ℃ 5 min，计算EV71 BJ病毒相对表达量。

2.3 大鼠血浆D-D、NSE和NPY水平检测分别在治疗第1天、第4天、第7天、第10天、第13天取大鼠尾静脉血，加入少量枸橼酸钠抗凝，3 000 g离心 15 min (离心半径10 cm)分离血浆。按照试剂盒说明书操作检测血浆D-D、NSE和NPY的水平，显色后使用酶标仪在450 nm波长处读出光密度值(optical density，OD)。根据标准品绘制标准曲线，根据OD值计算出D-D、NSE和NPY的水平。

3 结果

3.1 姜黄素对大鼠体质量的影响与第1天比较，第7天、第10天及第13天各给药组大鼠体质量显著升高(P<0.05)；与第4天比较，第7天、第10天及第13天各给药组大鼠体质量显著升高(P<0.05)，且呈时间依赖性；与对照组比较，模型组大鼠体质量显著下降(P<0.05)；与模型组比较，第7天、第10天及第13天各给药组大鼠体质量均显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 不同时间大鼠体质量的变化

3.2 姜黄素对模型大鼠肌肉组织病毒载量的影响与对照组比较，模型组大鼠肌肉组织EV71BJmRNA相对表达量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，各给药组大鼠肌肉组织EV71BJmRNA相对表达量显著下降(P<0.05)；与阿昔洛韦组比较，姜黄素高剂量组EV71BJmRNA相对表达量显著下降(P<0.05)，姜黄素低剂量组EV71BJmRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 EV71 BJ mRNA相对表达量

3.3 姜黄素对大鼠血浆D-D、NSE和NPY含量的影响随着给药时间的延长，各给药组大鼠血浆D-D、NSE和NPY水平均呈时间依赖性降低(P<0.05)；与对照组比较，模型组大鼠血浆D-D、NSE和NPY含量均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，各给药组大鼠血浆D-D、NSE和NPY含量均显著下降(P<0.05)。见表3-5。

表3 不同时间各组血浆D-D含量

表4 不同时间各组血浆NSE含量

表5 不同时间各组血浆NPY含量

4 讨论

重症手足口病患者的重要特征为中枢神经系统感染引起的脑炎、脑膜炎、神经元退行性病变等[7-8]。研究发现，引起手足口病的肠道病毒种类繁多，其中EV71属小RNA病毒科肠道病毒，是手足口病主要病原体之一，90%以上重症手足口病患者均由EV71感染所致[9-10]。EV71手足口病临床治疗尚无特效药，阿昔洛韦是临床常见的抗病毒药物，可干扰病毒复制，用于治疗手足口病[11]，可减少病毒载量，减轻组织损害[12]。研究显示，重组人干扰素可以通过调控Toll样受体/髓样分化因子通路治疗手足口病，减轻实验大鼠的炎症反应，改善T细胞免疫状态[13]。然而考虑到阿昔洛韦是主要的抗病毒药物，对病毒增殖有直接抑制作用，而重组人干扰素在临床实践中也多为手足口病的辅助治疗药物[14]，故本研究选用阿昔洛韦为阳性对照药物。

姜黄素是传统中药姜黄的主要活性成分之一，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗纤维化等作用[15-16]。研究表明，姜黄素可抑制柯萨奇病毒在小鼠体内增殖，对小鼠具有较强保护作用[17]。柯萨奇病毒与EV71同属于小RNA病毒科肠道病毒属，均是引起手足口病的病原体[18]。国内外相关研究均证实，姜黄素不仅可抗柯萨奇病毒和EV71，还可抑制呼吸道综合征病毒、高危型人乳头瘤病毒等的增殖，其主要作用机制包括破坏病毒结构、降低病毒活性、增强机体免疫抵抗力等[19-21]。因此，本研究探索姜黄素对感染EV71病毒的重症手足口大鼠的疗效，具有可行性。本研究结果显示，经过姜黄素治疗后，大鼠体质量显著升高，后肢肌肉病毒载量显著降低，由此可知，姜黄素对重症手足口病大鼠具有治疗效果。本研究结果与上述报道均相符，提示姜黄素在病毒感染性疾病治疗中有良好的开发前景，为手足口病新药的研发提供了新方向。

重症手足口病患者临床常出现神经源性肺出血、弥漫性血管内凝血、休克等，均是导致患者死亡的重要原因[22]。D-D是交联蛋白被水解后形成的降解产物，D-D浓度升高标志着机体出现高凝状态，与激发纤溶亢进，引起肺栓塞、冠心病、弥漫性血管内凝血等发生密切相关[23]。有研究表明，重症手足口病患儿血清中可检测到D-D浓度异常增高[24]。神经系统特异性蛋白NSE占脑可溶蛋白的1.5%，可从损伤神经元中漏出进入体循环，因此血浆中NSE水平可反映脑神经元损伤程度[25]，而手足口病患儿通常可检测出NSE显著升高[26]。NPY是一种神经多肽，在中枢神经系统中较为广泛存在，具有收缩血管的作用[27]。有研究表明，NPY水平升高可导致脑缺血缺氧损伤，引起脑水肿等，可能与重症手足口病患儿并发脑干脑炎的发病过程有关[28]。本研究结果显示，在重症手足口大鼠血浆中可检测到D-D、NSE、NPY显著升高，而经过姜黄素治疗后血浆D-D、NSE、NPY水平降低。既往也有报道，血浆NSE、NPY含量升高与手足口病神经功能损伤有关[29]，积极控制二者的水平对改善病患的预后意义重大。本研究结果与上述研究相符，据此可推测姜黄素对重症手足口大鼠的治疗作用可能与抑制D-D、NSE、NPY水平有关。

综上所述，姜黄素可升高大鼠体质量，降低病毒载量，对重症手足口病大鼠有治疗作用，且该作用可能与抑制D-D、NSE、NPY水平有关。本研究仅通过大鼠模型验证姜黄素对重症手足口病大鼠的疗效，但临床治疗重症手足口病患儿的有效性及可行性仍需进一步验证；另外，姜黄素调节血浆D-D、NSE、NPY水平的具体机制尚未明确，也需要深入探讨。