乙脑病毒重组酶介导逆转录扩增检测方法的建立

刘建礼 焦艳丽 董晨浩 楚单锐 种文文 肖利力（通信作者）海关总署（北京）国际旅行卫生保健中心（北京，100013）

孙慧晴 北京海关后勤管理中心（北京，100026）

日本乙型脑炎又称流行性乙型脑炎，是由乙型脑炎病毒（Japanese EncephalitisVirus，JEV）引起的一种蚊媒性人兽共患传染病，在我国属乙类传染病。乙脑现在的流行区域涉及亚洲、太平洋西部的24 个国家，其中以东亚和东南亚是最流行的区域。据世界卫生组织报告，尽管已广泛使用疫苗，但全球每年乙脑病例仍多达67 900 例，其中多数为10岁以下儿童，死亡率为20%～30%，30%～50%的存活者有神经麻痹后遗症，严重威胁人类健康［1］。

乙脑病毒属于黄病毒科（ Flaviridae）中的黄病毒属（ flavivirus）。病毒基因组是单股正链RNA，外面由一个50 nm 糖蛋白环绕的呈20 面体立体对称的核衣壳包裹着。病毒基因组全长11 kb，病毒基因组编码3 个结构蛋白（C 蛋白、PrM/M 蛋白、E 蛋白）和7 种非结构蛋白（ NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5）［2］。根据E 蛋白基因序列的同源性，可将JEV 分为进化关系上存在明显差异的5 个基因型，各基因型的分布有一定的区域性［3］。

目前比较常见的乙脑诊断方法有病毒分离、血清学诊断等。病毒分离培养是病毒检测的 “金标准”，但由于乙脑病毒载量低，利用细胞和小鼠来分离培养乙脑具有分离困难且工作量大、检测时间长的缺点。血清学诊断则存在灵敏度较低、与其它黄病毒属交叉反应的缺点［4］。

近些年分子检测技术成为传染病关注的热点。重组酶介导的等温核酸扩增技术（Recombinaseaidamplification，RAA）是近年新发展起来的一种快速核酸等温扩增检测方法，它可以实现常温条件下对目的基因进行等温扩增，具有简便、快速、灵敏的特点［5］。本研究探索建立了基于RT-RAA 技术的乙脑病毒快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

寨卡病毒核酸、登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、黄热病毒核酸为本实验室保存的阳性病例样本经核酸提取后保存于-70 ℃的核酸样本。

RT-RAA 基础荧光反应液、B6100 混匀器和1620 型恒温核酸扩增荧光检测仪均为江苏奇天基因生物科技有限公司产品。

1.2 乙脑病毒质粒标准品的构建

在GenBank 中查找乙脑病毒全基因组序列，运用DNASTAR 软件进行同源性分析，筛出高度保守序列。选取NS1 基因中选取一段序列作为待检测靶标，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成DNA 并制备成标准品质粒。

1.3 引物探针的设计和筛选优化

针对乙脑病毒NS1 基因区设计了上游引物和下游引物各3 条，引物和探针序列如表1 所示。

表1 乙脑病毒RAA 引物探针序列

将设计的3 条正向引物和3 条反向引物分别两两相互组合，形成9 对引物组合，与检测探针组成RT-RAA 检测反应体系，对引物和探针进行最佳配比筛选，通过荧光信号值的大小以及反应时间筛选最佳引物探针组合及反应体系条件。

1.4 RT-RAA 扩增体系及条件

在RT-RAA 干粉管中加入双蒸水16.7 μL、RAA 基础荧光缓冲液25 μL、正反向引物2.1 μL、探针0.6 μL 组成反应液，将反应液混匀，短暂离心，加2.5 μL 醋酸镁溶液，然后加入1 μL 阳性标准品或阴性对照。放入B6100 混匀仪39 ℃振荡混匀并预反应4 min，之后放入F1620 荧光检测仪中39 ℃扩增，观察荧光扩增曲线。

1.5 检测灵敏度

将乙脑病毒标准品质粒按10 倍比稀释，制备成1.0×101～1.0×105copies/μL 备用。利用上述优化好的RT-RAA 反应扩增体系依次对各浓度样品进行测定，考察方法的最低检测限

1.6 检测特异性

取寨卡病毒核酸、登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、黄热病毒核酸及正常人血液样本提取的核酸，利用上述优化的RT-RAA 反应扩增体系进行检测，考察检测方法的特异性。

2 结果

2.1 引物探针的筛选

本研究针对乙脑病毒的NS1 基因片段设计3条上游引物和3 条下游引物两两组合形成了9 对引物，分别与检测探针组合，用乙脑病毒质粒标准品进行探针优化筛选，结果如图1 所示，可见有3对引物扩增效果最好，其中F003R003 引物组合起峰时间最早，确定为最佳引物。

图1 不同引物组合RT-RAA 扩增曲线

2.2 检测灵敏度

将乙脑病毒标准品质粒系列稀释进行灵敏度测试，结果表明，建立的乙脑病毒RT-RAA 检测方法在最低10 copies 时仍然有明显的扩增曲线，且在10 min 左右就起峰。随检测靶标浓度升高，扩增起峰时间依次提前，1×105拷贝时反应2 min 即可检测到典型荧光扩增信号（图2）。

图2 乙脑病毒RT-RAA 的检测灵敏度

2.3 检测特异性

将登革病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒提取的核酸及正常人血液提取核酸进行乙脑病毒RT-RAA 检测，结果均未观察到有扩增曲线，说明建立的方法具有良好的特异性。

3 讨论

近年来，核酸检测方法由于灵敏度和特异性方面的优势，已成为病毒性传染病实验和临床检测的研究热点。尤其是2019 年新型冠状病毒的大暴发以来，我国核酸检测的整体水平得到迅猛提高。

病原体核酸检测最常用的方法是实时荧光PCR（RT-PCR），该方法灵敏度高、特异性好，目前已应用于多种细菌及病毒性传染病的诊断。孙莉等［6］研发的乙脑病毒的一步法RT-PCR 检测灵敏度可达5 拷贝/μL（20 拷贝/反应），特异性高，检测时间85 min。但RT-PCR 需要较昂贵的检测设备，对人员操作要求较高，对环境设施也有较高要求。

环介导的等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是另外一种常见的基因扩增检测方法，它通过采用具有高链置换活性的BstDNA 聚合酶，可以在等温条件下扩增目的基因，设备简单，检测速度也更快，是传染病分子诊断又一研究热点。卓泽文等［7］建立了乙脑病毒RT-LAMP检测方法，利用色素指示剂实现了可视化检测。但LAMP 技术引物设计复杂，灵敏度和特异性尚难以达到RT-PCR 的水平。

重组酶介导扩增方法（recombinase-aid amplification，RAA）是采用源于细菌或真菌的重组酶，在常温下可以与DNA 紧密结合，并与引物形成聚合体，在单链结合蛋白和DNA 聚合酶的作用下代替传统PCR 的热循环解链过程，实现了在37-39 ℃条件下对目的基因实现等温扩增，结合荧光探针，可以快速、灵敏地对病原体进行检测［4］。本研究选择乙脑病毒的NS1 基因片段设计了3 对引物，通过优化筛选确定了最佳引物组合和反应体系，建立了基于RTRAA 技术的乙脑病毒快速检测方法，本研究建立的方法检测灵敏度可达10 拷贝/反应，这相当于或略优于与RT-PCR 的检测灵敏度［5］。从检测时间来看，RT-RAA 检测方法在最低检测浓度下，上机反应后10 min 左右即可有典型的荧光信号；而高浓度下，最快仅需2-3 min 左右即可观察到明显的扩增，完成整个扩增检测过程也仅需20 min，整个检测时间仅为RT-PCR 的五分之一左右，也远远低于LAMP技术的50 min 左右的检测时长［8］。同时由于RAA技术所需检测设备更轻巧简便，易于携带，更适用于基层实验室和现场快速检测。

本研究初步建立了乙脑病毒RT-RAA 检测方法，该方法具有快速、灵敏度高，简便的特点，为口岸快速筛查提供了技术支持，具有良好的应用前景。