外界因素对TRUST 测定结果的影响

闫冀焕 沈 军 周新霞 苏丽红 张晓娜 河北国际旅行卫生保健中心（石家庄海关口岸门诊部）（河北，石家庄，050091）

陈 凯 江苏国际旅行卫生保健中心苏州分中心（江苏，苏州，215128）

人感染了梅毒螺旋体后可产生两类抗体，第一类为梅毒螺旋体的特异性抗体，通常在潜伏期或感染2 个星期左右时间产生，通过TP-ELISA、CMIA和TPPA 等实验方法，可进行梅毒螺旋体特异性抗体的测定；另一类为梅毒螺旋体的非特异性抗体（抗脂质抗体），较特异性抗体出现晚了2～3 周，可通过甲苯胺红不加热血清实验 （toluidine red untreated serum test，TRUST）［1］来检测。TRUST 广泛应用于人血清或血浆中反应素的检测，应用于出入境健康体检、梅毒病人辅助诊断及疗效评价［2］。TRUST测定原理是利用性病实验室玻片试验抗原（VDRL抗原）与试验抗体相结合，并重悬在特制的甲苯胺红溶液中，假如待测血清中存在反应素时，就能与VDRL 抗原产生凝集反应，从而出现肉眼可见的粉红色凝块进而判读结果。由于在TRUST 实验过程中所使用的心磷脂抗原并不是梅毒螺旋体本身或其菌体成分，故在检测某些自身免疫性疾病或某些特定疾病时，可出现假阳性现象［3-4］；并且当血清抗体浓度过高时，还易产生前带现象［5］，从而导致假阴性结果的出现。除去患者自身因素，在试验过程中各综合因素的影响，亦会使TRUST 结果出现假阳性［6-7］和假阴性［8-9］，比如实验温度、保存时间长短和温度高低、试剂盒的平衡时间长短、抗原和抗体的振荡反应时间长短、pH 值高低［10］以及凝集反应判读的主观差异等。为了更好地分析和研究外界影响因素所造成的TRUST 假阳性与假阴性的问题，本实验室在严格进行质量控制的前提下，深入探讨了这些外界影响因素对TRUST 结果的影响，以期为TRUST 检测的过程控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本来自于河北国际旅行卫生保健中心2017年1 月至2021 年12 月期间出入境健康体检人员，所有标本均采用具有分离胶的采血管采集血液，以3 000 r/min 离心10 min 后，再分离出血清，并要求肉眼观察血清中无脂血、黄疸和溶血现象，并剔除所有可能导致TRUST 测定出现假阳性结果的疾病标本［3-4］。

1.2 主要仪器和试剂

50 μL 微量移液器、水平旋转仪（转速100±2 r/min）、TRUST 反应 纸 卡、20 μL TRUST 专 用 滴管、高速离心机、4 ℃冷藏冰箱、-40 ℃冷冻冰箱；梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）试剂盒购自日本富士瑞必欧株式会社，TRUST 检测试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司，上述试剂均于4 ℃冰箱储存备用，用前充分恢复至室温；pH 试纸购自上海三爱思公司。

1.3 影响测定结果的外界因素

1.3.1 保存温度和时间

取TRUST 阴性标本30 例，TRUST 滴度1∶1（20例）、1∶2（15 例）、1∶4（10 例）、1∶8（10 例）、1∶16（10 例）和1∶32（4 例）的阳性标本（共计69 例，均经TPPA确认为阳性）。将血清标本分为3 份，依次分装于2.0 mL 螺口冻存管中，分装完立即将1 份血清放于常温，1 份血清放于4 ℃冰箱，1 份血清放于-40 ℃冰箱，并分别在保存后的1 d、3 d、7 d、10 d 取出，再次进行TRUST 检测并记录滴度。

TPPA 和TRUST 检测，必须严格按照试剂盒说明书进行手工操作，为避免实验者的主观干扰，要求所有实验操作、结果判读均由同一个人完成，质控必须在控。

1.3.2 反复冻融

30 例TRUST 阴性标本和69 例TRUST 阳性标本，放于-40 ℃冰箱的标本冻存时间达2 h，取出解冻后进行TRUST 测定，对TRUST 阳性者则继续检测滴度；测完后再立即冻存2 h，如此重复冻存4次，检测4 次。最后，将不同冻融次数的TRUST 测定结果与原始结果进行比较研究。

1.3.3 水平旋转仪振荡时间

TRUST 试剂盒说明书要求水平旋转仪振荡反应8 min 后立即观察结果。将30 例TRUST 阴性标本和69 例TRUST 阳性标本振荡时间延长至0.5 h，观察结果。

1.3.4 试剂盒平衡时间

30 例TRUST 阴性标本和69 例TRUST 阳性标本，用从4 ℃冰箱取出后室温平衡30 min 的试剂盒和室温保存1 周的试剂盒，分别进行滴度测定。

1.3.5 pH 值

TRUST 阴性标本30 例分别加入稀盐酸或稀氢氧化钠，配制成pH 1～14，再进行滴度检测。

1.3.6 电解质

以饱和氯化钠盐水代替说明书规定使用的生理盐水稀释标本，记录69 例TRUST 阳性标本最终滴度，并与原始滴度对比分析；30 例阴性标本分别稀释成1∶1、1∶2、1∶4 和1∶8，再进行滴度检测。

1.4 数据转换和统计学分析

利用对TRUST 滴度取倒数的自然对数后的数值，即LN 值（1/TRUST 滴度）进行统计学分析，并以“几何均数±标准差（G±SD）”的形式表达。所有数据采用SPSS 22.0 统计软件进行统计分析。组与组之间两两比较采用配对样本t 检验，P＜0.05 为具有统计学意义。

2 结果

2.1 保存时间和温度对TRUST 检测结果的影响

69 例TRUST 阳性标本，原始LN 值（1/TRUST 滴度）（G±SD）为1.17±1.06，在室温、4 ℃冷藏和-40 ℃冷冻3 种储存温度下，3 d 内，TRUST 检测结果稳定，均无显著性变化（P>0.05）；但从第7 天开始，TRUST 滴度出现了明显下降（P<0.05），并且标本保存时间越长，TRUST 滴度下降的越多（见表1）。

表1 保存时间和温度对TRUST 结果的影响

2.2 TRUST 阳性标本随保存时间和温度的滴度降低率和转阴率

在不同保存温度下，TRUST 阴性标本经检测后30 例仍为阴性结果；69 例TRUST 阳性标本随时间变化出现了滴度降低的现象。在相同保存温度下，除1∶32 实验组外，其他5 组，在相同保存天数下，滴度降低率最高的是1∶1 实验组；另外，从1∶1 到1∶16实验组，滴度降低率也呈现逐渐下降趋势。实验结果表明，TRUST 阳性标本保存时间越长，对TRUST滴度低的标本的测定结果影响越大。在常温和4 ℃的保存条件下，TRUST 测定结果由阳性转成阴性，均出现于1∶1 和1∶2 实验组；在-40 ℃保存条件下，7 d和10 d 分别有1 例和2 例TRUST 滴度为1∶4 的血清标本转为阴性（见表2）。

表2 TRUST 阳性标本在不同保存温度下随时间滴度降低率和转阴率[n（%）]

2.3 TRUST 阳性标本反复冻融后滴度变化情况

反复冻融1～4 次，对30 例TRUST 阴性标本无影响，复测仍为阴性。69 例TRUST 阳性标本复测后，出现滴度下降的趋势；与原始G±SD 比较，当冻融次数为1～2 次时，TRUST 滴度无明显变化 （P＞0.05）；但当冻融次数在3 次及3 次以上时，TRUST滴度呈明显下降趋势 （P＜0.05），滴度降低率≥23.19%（见表3）。

表3 TRUST 阳性标本反复冻融后滴度变化情况

2.4 水平旋转仪振荡时间对TRUST 检测结果的影响

将振荡时间由说明书规定的8 min 调整成0.5 h后，再重新读取TRUST 测定结果时，发现69 例TRUST 阳性标本复测后全部为阳性，而30 例TRUST 阴性标本中，出现1 例复测结果为弱阳性。

2.5 试剂盒平衡时间对TRUST 检测结果的影响

利用4 ℃冰箱至室温平衡30 min 的试剂盒复测，30 例TRUST 阴性标本和69 例阳性标本复测结果均与初测相同；用室温保存1 周的试剂盒复测，30 例TRUST 阴性标本复测结果均与初测相同，69例阳性标本中有2 例滴度为1∶1 的转为阴性。

2.6 pH 值对TRUST 检测结果的影响

将30 例TRUST 阴性标本分别加入稀盐酸或稀氢氧化钠，配制成pH 1～14 的血清溶液，再进行TRUST 检测，检测结果发现，当pH≤3 时，初测TRUST 阴性标本复测时会变成阳性。

2.7 电解质浓度对TRUST 检测结果的影响

利用饱和氯化钠盐水稀释，69 例TRUST 阳性标本的LN（1/TRUST 滴度）值G±SD 为1.71±1.00，相比原始的G±SD （1.17±1.06），TRUST 滴度明显升高，具有统计学意义 （P=0.026，P＜0.05）。30 例TRUST 阴性标本，经饱和氯化钠盐水稀释比例为1∶1 时，有18 例标本TRUST 结果由阴性转为阳性；稀释为1∶2 时，有24 例标本TRUST 结果由阴性转为阳性；稀释为1∶4 和1∶8 时，30 例TRUST 阴性标本全部由阴性转为阳性。

3 讨论

本实验室在检测卫生部临检中心梅毒抗体（非特异）室间质评标本时，多次出现检测结果不易判定的情况。由于每年室间质评标本都是以一次快件形式全部寄达实验室，需要在规定时限分两次测定，在快递运输以及实验室保存的待检过程中，会经过冷藏或冷冻储存不同时间才能完成测定。为此，观察保存时间和温度、振荡时间、反复冻融次数、试剂盒的平衡时间、pH 值及电解质浓度等外界因素对TRUST 检测结果是否具有影响，需深入探讨。

本实验结果表明，保存时间以及反复冻融次数对TRUST 结果稳定性具有很大的影响。新鲜标本在室温、4 ℃冷藏和-40 ℃冷冻储存，3 d 内TRUST 滴度基本保持稳定（P＞0.05）；第7 天后，TRUST 滴度出现下降趋势（P＜0.05），并且随着保存天数越长，滴度降低越多。这说明，血清反应素在体外会发生逐日降解现象，导致滴度逐日降低。血清标本冻融次数为1～2 次时，TRUST 结果稳定（P＞0.05）；但冻融次数高达3 次及3 次以上时，TRUST 滴度出现明显下降趋势（P＜0.05）。实验结果提示，在日常进行临床检测或室间质评标本检测时，收到标本后应及时测定，尽量避免保存时间长短和反复冻融次数这些影响因素对TRUST 测定结果的影响，若遇特殊原因无法及时检测时，收到样本后，应立刻放入2～8 ℃冰箱中保存，且保存时间尽量不要超过3 d，并且尽量避免反复冻融次数在3 次及3 次以上，否则可能会产生TRUST 检测结果假阴性或者检测滴度降低。

《梅毒非特异性抗体检测操作指南》（WST491-2016）［11］中建议，TRUST 测定时水平旋转仪应振荡8 min，并于3 min 内用肉眼观察结果，在将水平旋转仪的振荡时间由8 min 延长至0.5 h 后，观察结果发现，30 例TRUST 阴性标本中，有1 例出现假阳性结果，提示在检测过程中一定要严格按照操作规程执行，超过8 min 后未读取结果时必须重做TRUST检测，以避免结果出现错误。

《梅毒非特异性抗体检测操作指南》（WST491-2016）中建议，所有从4 ℃冰箱中取出的待检标本、检测试剂、阴阳性对照、质控血清等，均应放置在室温平衡30 min 后才可进行试验检测。将室温放置1周的试剂盒，与从4 ℃冰箱取出后室温平衡30 min的试剂盒分别进行TRUST 测定，结果发现，初测为TRUST 阴性的30 例标本，复测仍为阴性；初测为TRUST 阳性的69 例标本，复测后有2 例滴度为1∶1的转为阴性。假阴性结果的出现，说明TRUST 试剂盒在室温条件下存放时间过长可造成TRUST 检测试剂中的抗原滴度降低，进而影响TRUST 测定结果，尤其影响滴度低的阳性标本。由此推测，如果TRUST 试剂保存时间过长或者已经过期，也可能会造成抗原滴度降低，从而出现假阴性现象。建议各临床实验室在购买试剂前，尽量根据试剂的有效期计算好用量，以避免试剂存放时间过长而过期。假阴性现象的出现，从另一方面也提醒各临床实验室，在TRUST 测定中必须要做好阴性和阳性对照以及质控试验，以便有效监控试剂的质量。

本实验室还发现pH 值对TRUST 检测结果有影响，尤其是在标本pH≤3 时会导致TRUST 假阳性。假阳性现象的出现，提示各临床实验室，在TRUST 测定过程中，应严格对试验的每一个环节进行控制，以防止标本被酸性试剂污染［10］。利用饱和氯化钠盐水代替生理盐水稀释标本后，不但TRUST阳性标本的滴度明显升高，而且阴性标本也变成了阳性。分析假阳性出现的原因，可能是由于饱和氯化钠盐水破坏了蛋白质胶体稳定性，而使蛋白质发生盐析沉淀反应，沉淀物黏附在抗原颗粒表面，从而产生假阳性现象。为此，各临床实验室在TRUST测定时，一旦高钠血症和严重脱水等病人出现了TRUST 结果阳性时，一定考虑到假阳性结果的可能，综合分析，避免出现结果误判。

综上所述，虽然TRUST 广泛应用于出入境人员健康体检、梅毒患者筛查和疗效观察，但存在一定的假阴性和假阳性现象。本实验室通过一系列试验，研究探讨了引起TRUST 假阴性和假阳性结果的影响因素，并针对这些影响因素给出了自己实验室的经验、意见和建议，旨在进一步提高TRUST 检验结果的准确性和正确性，以减少临床上对梅毒相关疾病的漏诊和误诊。