基于网络药理学的山豆根保肝作用药效物质筛选及实验验证

秦妍，包永睿，2，王帅，2，李天娇，2，张秀君，孟宪生，2*（. 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连6600；2. 辽宁省中药多维分析专业创新技术中心，辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600；. 丹东药业集团有限公司，辽宁 丹东 80）

肝病一直以来都是全球面临的公共问题和社会问题，包括脂肪性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等[1]。目前，世界卫生组织统计数据表明[2]，全球约有2.4亿慢性乙肝病毒携带者和1.5 亿慢性丙肝病毒感染者。其中，慢性乙型肝炎患者中有10%～20%进展为肝硬化；2020年，全球肝癌发病人数高达90.5677 万人，因肝癌死亡人数为83.0180 万人。肝病发病原因众多，氧化应激毒性、胆汁酸异常代谢、噬肝性病毒、miRNA 调控可能是造成肝脏疾病主要危险因素[3]。除此之外，酒精、肥胖、遗传因素、饮食状况等也与肝病的发生发展有关。目前，临床上治疗肝病的抗病毒药物层出不穷，其机制主要为抑制病毒的复制。但对于肝硬化、原发性肝癌患者，更多的治疗手段也难以控制疾病的进程，因此迫切需要寻找毒副作用低、安全有效的治疗药物。

山豆根为豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根茎，始载于《开宝本草》，《植物名实图考》中记载，山豆根解毒功热甚效，与临床消热解毒的效用一致[4]。山豆根具有多种不同生物活性成分，包括生物碱类、黄酮类、多糖类、酶、核苷酸和微生物等。山豆根具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、保肝、抗病毒、抗氧化、免疫调节、抗炎、改善心血管系统等[5-9]。体内外试验研究表明，山豆根及其主要活性成分在治疗肝癌、抑制新生血管生成、保护肝损伤方面发挥着重要作用。本实验采用微流控芯片技术始终保持给药持续性，更加接近人体真实环境。静态培养易出现药物蓄积等情况，而微流控芯片采用低剪切力灌注不会因药物蓄积而影响药物释放，因而也避免了因侵袭作用结果不准确的问题。酶联免疫吸附法将抗原抗体亲和反应的高度特异性与酶催化反应的放大作用相结合，在本实验中通过颜色反应来进行定量分析，操作简单方便、灵敏度高、检测结果相对可靠。

本实验室前期研究发现，从山豆根中提取的山豆根生物碱能不同程度地减少肝组织中VEGF、PI3K mRNA 的表达，增加PTEN mRNA 的表达，其作用机制与环磷酰胺相似[10]。然而由于山豆根活性成分的多样和结构复杂，难以获得山豆根保肝作用的药效物质基础。因此本研究首先通过中药网络药理学，预测山豆根抗肝炎、肝硬化、肝癌的潜在药效物质。进一步采用微流控芯片技术进行验证，以期为山豆根保肝作用的相关靶点及机制阐述提供理论依据。

1 材料

1.1 试药

槲皮素（批号：100081-201509，中国食品药品检定研究院）；山柰酚（批号：JOT-10193）、异鼠李素（批号：JOT-10450）（成都普菲德生物技术有限公司）；脂多糖（批号：HY-D1056，Sigma公司）。0.1%结晶紫染色液（北京索莱宝科技有限公司）；冰醋酸（批号：20181123，分析纯，天津科密欧有限公司）；Corning Matrigel 基质胶（批号：6235004，美国Gibco 有限公司）；胎牛血清（批号：S0901A，美仑生物技术有限公司）；肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒（批号：KE00068，Proteintech 公司）；白介素-6（IL-6）酶联免疫吸附测定ELISA 试剂盒（批号：E-EL-R0015c，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。

1.2 细胞株

人正常肝细胞（L-02）、小鼠肝星形细胞（HSC-T6）、人肝癌细胞（HepG-2）[赛百慷（上海）生物技术股份有限公司]。

1.3 仪器

SUNRISE 酶标仪（瑞士TECAN 公司）；NIKON ECLIPSE TI 荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；JKG-2A 型光刻机（上海学泽光学机械有限公司）；HPDC32G2 型等离子清洗机（美国Harrick Plasma 公司）；KW-4A 型匀胶机（昆山力电精密机械有限公司）；LSP04-1A 精密注射泵（保定兰格公司）。

2 方法

2.1 药理学研究

2.1.1 山豆根有效化学成分与靶点的收集 在TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）数据库中检索山豆根的有效化学成分及成分对应的靶点，筛选条件为口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18，根据筛选所得的山豆根活性成分获取所对应的靶标，利用UniProt（https：//www.uniprot.org）数据库，限定物种为“Homo sapiens”，收集山豆根活性成分对应靶点的基因名。

2.1.2 疾病靶点的收集 利用GeneCards（https：//www.genecards.org）数据库（相关性评分≥1.0）、DrugBank（https：//www.drugbank.com） 数据库、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd） 数 据 库、OMIM（https：//omim.org）数据库、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org）数据库，以“cirrhosis”“chronic hepatitis” “liver cancer”作为检索词分别检索。合并去除重复基因后，收集相关的靶点。

2.1.3 山豆根“化学成分-靶点”网络的构建 将山豆根化学成分与靶点信息导入Cytoscape 3.8.2软件中，利用R 语言获取山豆根和肝病的共同靶点，同时构建“山豆根-成分-靶点”网络。

2.2 实验验证

2.2.1 基于细胞侵袭特征的微流控芯片构建 采用CorelDraw X7 矢量制图软件进行芯片设计，结合高分辨率打印机以胶印的方式输出至透明菲林片上制成掩膜。

2.2.2 脂多糖诱导L-02 细胞损伤模型的制备 将细胞随机分为0（空白对照组）、5、10、15、20、25 mg·L-1的脂多糖组，每孔5 个复孔。待细胞基本完全贴壁后，加入不同质量浓度的脂多糖，于培养箱中培养3、6、9、12、24、48 h，用CCK-8法检测各组细胞的存活情况，确定肝损伤模型。

2.2.3 体外侵袭药效学评价 根据实验设计，将基质胶与无血清的DMEM 混匀后缓慢注入芯片上层通道内，待基质胶固化后将脂多糖处理的L-02 肝损伤模型[11]、HSC-T6、HepG-2 分别接种于上层通道内，并在芯片下层通入含有2%FBS的DMEM 培养液，待细胞稳定生长后，借助蠕动注射泵以0.1 μL·min-1的速度对上层通道通入含药培养液，以1 μL·h-1的速度对下层通入含有10%FBS 的细胞培养液。

给药干预24 h 后，分离两层通道层，取出微孔滤膜放置12 孔板中，使用0.1%的结晶紫染色液对微孔滤膜进行浸泡染色15 min；使用生理盐水洗掉多余染料后，置于培养箱内烘干；烘干后在各个孔内加入1.5 mL 33%的醋酸，置于摇床上进行脱色处理，10 min 后收集洗脱液，借助酶标仪在570 nm 下读取OD值，以空白组的OD值为参照，计算相对侵袭率。相对侵袭率（%）＝（OD给药/OD空白）×100%。

2.2.4 ELISA 法检测上清中TNF-α及IL-6 水平

将处于对数生长期的L-02、HSC-T6、HepG-2细胞，以5×105个/孔接种于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至70%～80%时，加入终浓度为0、150、200、250 μmol·L-1的槲皮素、山柰酚、异鼠李素培养24 h 后，收集各组细胞培养上清，严格按照试剂盒说明书操作，检测TNF-α和IL-6 水平。

2.2.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 山豆根药理学研究结果

3.1.1 山豆根活性成分收集结果 共得到山豆根的活性成分21 个。去除无靶点的成分共得到山豆根活性成分10 个，主要包括黄酮类化合物（如槲皮素、山柰酚）、生物碱类（如槐果碱、槐醇）、异黄酮类（如芒柄花素），以及酮类（如异鼠李素）。这些主要的活性有效成分均有不同程度的抗炎、抗肿瘤作用。

3.1.2 肝病潜在靶点的收集 GeneCard 数据库中检索到与肝炎、肝硬化、肝肿瘤关联基因12 450个，DrugBank 数据库中检索到105 个，TTD 数据库中检索到130 个，OMIM 数据库中检索到167个关联基因以及 PharmGkb 数据库中检索到320个相关基因，删除共有的基因，共得到12 648 个疾病关联基因。

3.1.3 山豆根-活性成分网络构建 将收集的174 个山豆根潜在靶点与肝癌的12 646 个潜在靶点相匹配，得到山豆根和肝病的共同靶点（170个），将山豆根药材与其所含有效活性成分及靶点相互对应，并运用 Cytoscape 3.8.2 软件构建相互关系，见图1，其中槲皮素富集的靶点最多。

图1 山豆根-活性成分网络构建Fig 1 Network construction of active components in Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma

3.2 细胞侵袭实验验证

3.2.1 构建细胞侵袭特征的微流控芯片 本实验所用芯片设计为四层，呈现中心对称结构，设计图及实物图见图2。该芯片从下至上依次是玻璃基底层、流体通道层B、三层微孔滤膜层以及流体通道层A，三层微孔滤膜结构单元通过静电吸附作用键合在一起，PDMS 层通过热键合处理，实现可逆封接，以便后续去除固定，并且每层都有独立的药液入口及废液口。

图2 细胞侵袭特征微流控芯片设计图及实物图Fig 2 Design drawing and physical drawing of microfluidic chip with cell invasion characteristics

3.2.2 脂多糖处理的L-02 肝损伤模型的建立 由图3可知，脂多糖对肝细胞活力的影响具有剂量依赖性；脂多糖作用24 h，其存活率接近线性变化；但时间超过24 h，各组细胞增殖活力均下降。15、20、25 mg·L-1脂多糖作用12、24、48 h条件下，除15 mg·mL-1作用12 h 细胞存活率降低不明显，各组均可明显降低肝细胞活力。质量浓度为20 mg·L-1，作用24 h 时，其存活率为50.66%，从存活曲线来看，选择接近线性变化的中间剂量20 mg·L-1脂多糖，作用24 h 作为致肝损伤造模剂量[12]。

图3 不同质量浓度脂多糖对各组肝细胞存活率的影响Fig 3 Effect of different concentrations of lipopolysaccharide on the survival rate of hepatocytes in each group

3.2.3 细胞侵袭实验结果 不同质量浓度药效单体干预下的细胞侵袭活性结果见图4。与空白对照组相比，3 种药效单体均能显著抑制细胞侵袭，呈剂量依赖性，特别是槲皮素（6 μg·mL-1）和异鼠李素（6 μg·mL-1）抑制HepG-2 细胞侵袭作用明显。

图4 槲皮素（A）、山柰酚（B）、异鼠李素（C）对L-02 肝损伤模型及HSC-T6、HepG-2 细胞的相对侵袭率Fig 4 Relative invasion rate of quercetin（A），kaempferol（B）and isorhamnetin（C）on L-02 liver injury model，HSC-T6 and HepG-2 cells

3.2.4 ELISA 实验结果 与空白对照组比较，细胞培养上清中TNF-α和IL-6 水平有所降低，中、高浓度组最为明显，仅有槲皮素中浓度组对HSC-T6 的IL-6 的影响无统计学意义，另外槲皮素、山柰酚、异鼠李素（200、250 μmol·L-1）组细胞培养上清中TNF-α和IL-6 水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），见表1。

表1 L-02 肝损伤模型及HSC-T6、HepG-2 细胞ELISA 实验结果Tab 1 ELISA of L-02 liver injury model，HSC-T6 and HepG-2 cell invasion

4 讨论

肝脏疾病的治疗与预防一直以来都是公共卫生领域的热点问题，肝脏不仅参与代谢、消化，在维持机体平衡方面也具有至关重要的作用。“慢性肝炎-肝硬化-肝癌”是公认的肝脏疾病三部曲，抑制疾病的发展进程将可能避免肝癌的发生。

本研究利用“有效成分-靶点”网络分析了山豆根药效物质，进一步明确化学成分与靶点之间的相互作用关系。其中，药理网络中排名前三位的化学成分依次为槲皮素、山柰酚、异鼠李素，均为黄酮类。槲皮素具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗细胞凋亡等多种药理作用[13]。Lu 等[14]研究显示，槲皮素可通过调控PI3K/Akt 信号通路，下调MMP-2 和MMP-9D 的表达，进而抑制重组质粒转染组HC-CLM3 细胞的迁移和侵袭。Liu 等[15]研究发现槲皮素可显著降低血清转氨酶和总胆汁酸水平，减少促炎因子及IL-6 的释放，通过降低氧化应激、减轻炎症，发挥对肝脏潜在的保护作用。山柰酚是多种植物性食品中一类主要膳食黄酮，日常食用富含山柰酚的食物能够降低肝癌、动脉粥样硬化的发病风险，通过抑制细胞凋亡、下调上皮-间质相关信号，调节PI3K-PKB 信号通路而发挥作用[16]。异鼠李素可以显著阻止四氯化碳（CCl4）或胆管结扎诱导的肝纤维化，降低磷酸化Smad 蛋白（Smad3）、减少细胞外基质（ECM）的形成及自噬、抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）和p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路的传导，从而预防肝纤维化[17]。

综上所述，本研究通过网络药理学揭示了山豆根的药效物质，其可通过调节多个靶点共同作用实现保肝护肝作用。结合微流控芯片技术及体外ELISA 实验，验证了网络药理学的预测结果，对于下一步分子机制研究具有重要的意义。