绿原酸对脓毒症致大鼠急性肾损伤的保护作用

冯秀晶 ， 辛 秀 ， 黄 静 ， 赵玉博 ， 刘敬轩 ， 唐琦超

(1.吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.预防兽医学吉林省重点实验室 ， 吉林 吉林 132101)

目前兽医临床常见的子宫蓄脓、深层脓皮症或严重外科感染等，因感染较严重或者治疗不及时等原因，常常会继发脓毒症，导致动物多器官功能障碍，甚至死亡[1]。脓毒症的发病率和病死率都极高，一项研究表明，伴有器官衰竭的脓毒症的犬的发病率和病死率分别高达70%和47%[2-3]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作为内毒素的主要成分，广泛用于在动物模型中复制试验性脓毒症诱导的多器官损伤[4]，其中肾脏是其主要损伤的靶器官。目前兽医临床尚未开发出针对脓毒症致急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)的有效治疗药物和干预措施。绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)是杜仲、金银花、绿咖啡豆等众多中草药的活性成分之一，具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗炎等功效[5]。有研究表明，CGA作为金银花提取物的主要抗炎成分，可通过抑制机体炎症反应，改善LPS诱导的小鼠内毒素血症及其导致的肺损伤[6-7]，也可提高盲肠结扎和穿孔诱导的脓毒症大鼠的存活率。此外，CGA还可通过激活核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)信号通路，改善机体氧化应激反应，减少炎症因子及自由基生成，减轻脓毒症大鼠炎症反应[8]。但对于CGA是否能够对脓毒症致AKI发挥保护作用仍未可知。因此，本试验建立大鼠脓毒症致AKI模型，应用CGA进行干预，探究CGA对脓毒症致AKI的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲养 40只健康成年雄性SD大鼠，体重220～250 g，购自吉林大学实验动物中心。大鼠饲养在标准实验室中，保持通风良好，温度控制在 22～24 ℃，相对湿度保持在45%～55%，自由采食饮水，所有大鼠在试验前适应环境1周。

1.2 主要试剂 脂多糖(LPS)，购自Sigma-Aldrich公司；绿原酸(CGA)，购自Sigma-Aldrich公司；肾损伤分子1(Kidney injury molecule 1，KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(Interleukin 6，IL-6)、白细胞介素1β(Interleukin 1β，IL-1β)、白细胞介素18(Interleukin 18，IL-18)、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血红素氧合酶1(Heme oxygenase-1，HO-1)、醌氧化还原酶1(Quinone oxidoreductase 1，NQO1)抗体，均购自沈阳万类生物科技有限公司；核因子E2相关因子2(Nrf2)抗体，购自Santa Cruz公司；4%多聚甲醛、BCA试剂盒和RIPA裂解液，均购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 仪器设备 RM2245半自动轮转式切片机，购自德国Leica公司；SK210生物显微镜，购自麦克奥迪实业集团有限公司；1-14K高速低温离心机，购自Sigma公司；VERSA max酶标仪，购自美国Molecular Devices公司；SCIENTZ-48L组织研磨仪，购自宁波新芝生物科技股份有限公司；Tocan恒温摇床，购自上海领成生物科技有限公司；PHS-3C型自动pH计，购自上海仪电科学仪器股份有限公司；YXQ-50S11高压蒸汽灭菌器，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；通用型电泳仪、转膜仪，均购自美国Bio-Rad公司；Chemi XT4化学发光分析系统，购自基因有限公司。

1.4 试验分组及处理 将40只健康成年雄性SD大鼠随机分为5个组，分别为对照组(CON组)、绿原酸组(CGA组)、模型组(LPS组)、绿原酸干预组(CGA+LPS组)和Nrf2抑制剂组(ML385+CGA+LPS组)，每组8只。CON组不做任何处理；CGA组腹腔注射CGA[20 mg/(kg·bw)，溶于无菌生理盐水]；LPS组腹腔注射LPS[10 mg/(kg·bw)，溶于无菌生理盐水]；CGA+LPS组腹腔注射CGA[20 mg/(kg·bw)]，1 h后腹腔注射LPS[10 mg/(kg·bw)]；ML385+CGA+LPS组腹腔注射ML385[Nrf2抑制剂，30 mg/(kg·bw)]，30 min后其余处理同CGA+LPS组。

1.5 样品收集与处理 大鼠腹腔注射LPS 4 h后，使用异氟醚麻醉，通过膀胱采集尿液样本、心脏采集血液样本，将尿液和血液样本放在室温静置30 min后，4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用于肾脏功能和血清炎症因子检测；取左侧肾脏组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于苏木精-伊红(H.E.)染色和免疫组化试验；取右侧肾脏组织，放入-80 ℃保存，用于氧化应激指标检测和Western blot试验。

1.6 大鼠肾脏功能检测 使用全自动生化分析仪测定血清尿素氮(Urea nitrogen,BUN)和肌酐(Creatinine,Cre)的水平。按照ELISA试剂盒说明书操作，测定尿液中KIM-1和NGAL的水平。

1.7 大鼠血清炎症因子检测 按照ELISA试剂盒说明书操作，测定大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平。

1.8 大鼠肾脏H.E.染色 肾脏在4%多聚甲醛溶液中至少固定24 h后，在梯度乙醇中进行脱水，二甲苯透明后，进行石蜡包埋、切片、染色，光学显微镜对肾脏切片进行观察。参照参考文献[9]方法，使用0～4分制对肾皮质肾小管损伤程度进行分级：0=正常；1=轻度损伤(<25%)；2=中度损伤(25%～50%)；3=严重损伤(50%～75%)；4=更严重损伤(>75%)。

1.9 大鼠肾脏氧化应激指标检测 根据试剂盒说明书操作，检测肾脏组织ROS、MDA含量和SOD活性。

1.10 Western blot法检测蛋白表达量 称取100 mg大鼠肾脏组织，加入RIPA裂解液后，匀浆取上清液备用，进行蛋白浓度测定(BCA法)，向蛋白样本中按比例加入蛋白上样缓冲液和稀释液，充分混匀，在金属浴中煮沸10 min，室温冷却后存储于-80 ℃冰箱中保存备用。通过制备分离胶和浓缩胶、电泳、转膜、封闭、一抗孵育(Nrf2、HO-1和NQO1)、二抗孵育、洗膜、滴加ECL发光液后，进行化学发光检测。

1.11 免疫组化法检测Nrf2细胞核易位情况 肾脏组织蜡块用二甲苯脱蜡，不同浓度乙醇水化，3% H2O2孵育封闭。在室温下与山羊血清孵育后，将Nrf2抗体加入封闭液中，4 ℃过夜孵育后，与相应二抗结合，在37 ℃孵育30 min，用DAB洗涤和显色。切片用苏木精复染，使用光学显微镜观察染色切片。

2 结果

2.1 CGA对LPS致AKI大鼠肾脏功能的影响 大鼠肾脏功能检测结果见图1，与CON组相比，LPS组血清BUN和Cre水平、尿液KIM-1和NGAL水平极显著升高(P<0.01)；与LPS组相比，CGA+LPS组血清BUN和Cre水平、尿液KIM-1和NGAL水平极显著降低(P<0.01)；与CGA+LPS组相比，ML385+CGA+LPS组上述4个指标水平极显著升高(P<0.01)；CON组与CGA组相比，上述4个指标无统计学差异(P>0.05)。

图1 各组大鼠肾脏功能检测Fig.1 Kidney function of rats in each group与CON组相比，* ：差异显著(P < 0.05)，** ：差异极显著(P<0.01)；与LPS组相比，##：差异极显著(P<0.01)；与CGA+LPS组相比，&&：差异极显著(P<0.01)；下同Compared with the CON group, * : significant difference(P < 0.05), ** : extremely significant difference(P<0.01); Compared with the LPS group, ##: extremely significant difference(P<0.01); Compared with the CGA+LPS group, &&: extremely significant difference(P<0.01). The same as below

2.2 CGA对LPS致AKI大鼠血清炎症因子的影响 大鼠血清炎症因子检测结果见图2，与CON组相比，LPS组血清TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平极显著升高(P<0.01)；与LPS组相比，CGA+LPS组血清TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平极显著降低(P<0.01)；与CGA+LPS组相比，ML385+CGA+LPS组上述4个指标的水平被明显逆转，极显著升高(P<0.01)；CON组与CGA组相比，上述4个指标无统计学差异(P>0.05)。

图2 各组大鼠血清炎症因子检测Fig.2 Serum inflammatory factors of rats in each group

2.3 CGA对LPS致AKI大鼠肾脏组织显微结构的影响 对肾脏组织进行病理组织学观察，结果见封二图3A，CON组和CGA组肾小管和肾小球结构均正常；LPS组肾小管出现严重的扩张或肿胀、空泡变性、炎性细胞浸润、肾小管局灶性坏死等明显的病理变化；CGA+LPS组可见肾小管损伤减轻，表现为肾小管轻度扩张，少量炎症细胞浸润；ML385+CGA+LPS组明显逆转了CGA的保护作用，病理变化同LPS组。大鼠肾组织病理学损伤评分结果见封二图3B，与CON组相比，LPS组肾小管损伤评分极显著升高(P<0.01)；与LPS组相比，CGA+LPS组肾小管损伤评分极显著降低(P<0.01)；与CGA+LPS组相比，ML385+CGA+LPS组肾小管损伤评分极显著升高(P<0.01)。

2.4 CGA对LPS致AKI大鼠肾脏氧化应激指标的影响 大鼠肾脏氧化应激指标检测结果见封二图4，与CON组相比，LPS组ROS、MDA水平极显著升高(P<0.01)，SOD活性极显著降低(P<0.01)，CGA+LPS组MDA水平显著升高(P<0.05)；与LPS组相比，CGA+LPS组ROS、MDA水平极显著降低(P<0.01)，SOD活性极显著升高(P<0.01)；与CGA+LPS组相比，ML385+CGA+LPS组ROS、MDA水平极显著升高(P<0.01)，SOD活性极显著降低(P<0.01)。

2.5 CGA对LPS致AKI大鼠Nrf2/HO-1通路蛋白表达的影响 Western blot结果见封三图5，与CON组相比，LPS组N-Nrf2蛋白表达量显著升高(P<0.05)，其余蛋白表达量差异不显著(P>0.05)，CGA+LPS组N-Nrf2、T-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达量极显著升高(P<0.01)；与LPS组相比，CGA+LPS组N-Nrf2、T-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达量极显著升高(P<0.01)；与CGA+LPS组相比，ML385+CGA+LPS组N-Nrf2、T-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达量极显著降低(P<0.01)。

2.6 CGA对LPS致AKI大鼠Nrf2表达的影响 免疫组化检测结果见图6，与CON组相比，LPS组Nrf2细胞核易位差异不显著(P>0.05)，CGA+LPS组Nrf2细胞核易位情况极显著升高(P<0.01)；与LPS组相比，CGA+LPS组Nrf2细胞核易位情况极显著升高(P<0.01)；与CGA+LPS组相比，ML385+CGA+LPS组Nrf2细胞核易位情况极显著降低(P<0.01)。

图6 各组大鼠肾脏Nrf2免疫组化染色Fig.6 Nrf2 immunohistochemical staining of rat kidneys in each group

3 讨论

内毒素是导致脓毒症的常见原因[10]。LPS作为内毒素的主要成分，已被报道参与脓毒症的病理过程[11]。因此，根据先前的研究结果[12]，本试验通过腹腔注射LPS[10 mg/(kg·bw)]4 h，建立大鼠脓毒症模型。此外，大量动物模型的相关研究已经证明CGA 对肾功能存在有益影响[13-14]。BUN和Cre是肾损伤的常规和关键标志物，而KIM-1和NGAL被确定为AKI的生物标志物。本试验发现，CGA显著减弱了LPS诱导的上述4种标志物的产生，表明CGA对LPS诱导的肾损伤具有显著的改善作用。此外，CGA干预显著减轻了LPS诱导的肾脏显微结构损伤。因此，本试验结果证实，CGA对 LPS诱导的大鼠AKI具有显著的保护作用。

以往研究表明，炎症反应在脓毒症致AKI的起始和延伸阶段都发挥着重要的作用，炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-1等分泌增加均可促进AKI的发生发展[15-16]。这与本试验结果相一致，LPS组血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平显著升高，表明炎症反应是脓毒症致AKI的主要致病机制。CGA预处理后显著降低了TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β水平，这与之前的结果一致[17]，表明CGA介导的炎症抑制在缓解LPS诱导的AKI中发挥重要作用。以上结果表明，炎症反应在LPS致AKI的过程中发挥着重要的作用，因此，抑制机体炎症反应可能是多种药物防治脓毒症致AKI的关键作用靶点。

ROS诱导的氧化损伤可促进AKI的发生发展。CGA预处理可以减轻大鼠肾脏损伤和氧化炎症[18]。本试验分析了肾脏氧化应激标志物ROS和MDA的含量以及抗氧化剂SOD的活性。与对炎症标志物的影响一致，CGA治疗逆转了LPS诱导的ROS和MDA水平的增加以及SOD活性的降低，表明CGA在减少LPS诱导的氧化损伤方面发挥着重要作用。因此推测CGA可通过调节氧化和抗氧化状态之间的平衡，从而保护肾脏组织免受氧化应激引起的损伤。

绿原酸(CGA)广泛存在于多种植物中，是许多中药材和中成药的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种药用功效。有研究表明，CGA对盲肠结扎穿刺法(CLP)诱导的小鼠脓毒症死亡率和多器官损伤具有显著的保护作用[19]。本试验发现，CGA显著改善了脓毒症大鼠肾脏功能，恢复肾脏器质性损伤。此外，有研究表明CGA可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平，从而减轻LPS诱导的AKI[20]。本试验结果表明，CGA显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的产生，表明抑制这些炎症因子的释放是CGA对LPS诱导的AKI的保护机制之一。

为进一步探究CGA对机体炎症反应和氧化应激抑制作用的具体机制，本试验检测了CGA对Nrf2信号通路及其下游HO-1和NQO1蛋白表达的影响。研究表明，CGA可以通过调节Nrf2/HO-1信号通路和NF-κB途径来抑制氧化应激和炎症反应，从而预防糖尿病性肾病[21]。此外，CGA可能通过增强Nrf2介导的抗氧化途径和抑制NLRP3炎性小体激活来预防四氯化碳诱导的急性肝损伤[22]。CGA通过Nrf2/HO-1通路对血管衰老发挥保护作用[23]。本试验结果显示，CGA显著提高了Nrf2的表达，诱导Nrf2的核易位增多，并增加了下游HO-1和NQO1蛋白的表达。本试验表明，CGA对LPS导致的炎症反应和氧化应激的抑制作用可能是通过调节Nrf2/HO-1途径发挥的。为进一步验证该猜想，本试验应用了Nrf2抑制剂ML385，结果表明，CGA对机体炎症反应和氧化应激的抑制作用完全被ML385逆转，表明CGA对LPS导致的炎症反应和氧化应激的抑制作用是通过激活Nrf2信号通路实现的。

综上所述，CGA通过激活Nrf2信号通路，促进Nrf2核易位及下游靶蛋白HO-1和NQO1表达，抑制机体炎症反应和氧化应激，阻断下游炎症级联瀑布反应和氧化损伤，从而对LPS诱导的AKI发挥保护作用。本试验为CGA在临床上预防和/或治疗脓毒症致AKI提供理论依据及试验基础，并完善了CGA的药理作用分子机制。