低纬高原甘蔗锈病病原菌鉴定及系统进化分析

王晓燕，李文凤，张荣跃，单红丽，李 婕，李银煳，黄应昆

(云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南 开远 661699)

【研究意义】锈病是一种重要的世界性甘蔗真菌病害，可造成甘蔗减产15%～30%，蔗糖分降低10%～36%，严重制约蔗糖产业的高质量发展[1-2]。以病原菌研究为基础的抗病品种筛选与种植是防治此病最经济有效的措施，因此探明低纬高原云南蔗区锈病的病原菌种类、发生分布特征、病菌间及其与柄锈菌属其他锈菌的系统进化关系，对病害的精准科学防控具有重要意义。【前人研究进展】甘蔗锈病病原有3种，即褐锈病病原黑顶柄锈菌(PuccinamelanocephalaSyd. et P. Syd)、黄锈病病原屈恩柄锈菌(PuccinakuehniiButler.)[3]和黄褐锈病病原Macruropyxisfulvasp. nov.[4]。1890年褐锈病首次在爪哇发现，此后该病在多数植蔗国家普遍发生，爆发流行，给当地经济造成巨大损失[5-8]。黄锈病主要分布在澳大利亚、拉丁美洲、美国和印度等国[9-12]。黄褐锈病是2008年在斯威士兰甘蔗品种N25上发现的一种新型甘蔗锈病，目前该病在南非和斯威士兰蔗区普遍发生[4]。阮兴业等[13]1982年在云南首次发现了褐锈病，随后该病迅速蔓延到我国各主要植蔗区[14-17]。【本研究切入点】低纬高原云南蔗区是中国第二大甘蔗产区，甘蔗锈病在该产区普遍发生，且有逐年扩展蔓延加重危害之趋势，但其病原菌种类、发生分布特征、病菌间及其与柄锈菌属其他锈菌的系统进化关系等方面尚不明确，有效防控缺乏科学依据。【拟解决的关键问题】通过对低纬高原云南不同蔗区甘蔗锈病发生分布状况进行系统调查，采用病原形态特征观察及分子检测等方法鉴定病原种类，并对57份甘蔗锈病样品的rDNA序列进行克隆测序，分析甘蔗锈菌间及其与柄锈菌属其他锈菌的系统进化关系，以期明确低纬高原云南蔗区甘蔗锈病病原菌种类和揭示甘蔗锈病分离物的分子进化，为甘蔗锈病的流行预测、抗病育种及精准防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查及症状观察

2014—2018年，先后对云南保山、临沧、勐海、孟连、西盟、澜沧和文山等蔗区甘蔗锈病的发生和分布进行了调查并采集57份不同锈病症状的病叶，观察病害症状(表1)。

表1 57份甘蔗锈病样品病原菌鉴定Table 1 Pathogen identification of 57 sugarcane rust samples

续表1 Continued table 1

1.2 病原形态学观察

观察和测量具典型锈病症状病叶上的夏孢子堆大小、颜色和形态，然后用灭菌刀片刮取夏孢子在显微镜下进行形态、颜色、芽孔数和有无侧丝等特征的观察，并随机测量100个夏孢子的大小。

1.3 病原分子鉴定及系统发育树的构建

各锈病样品称取病叶0.2 g，采用北京全式金生物技术公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit提取叶片总DNA。采用参照文献报道的锈菌特异性引物Rust2inv/LR6[18]进行PCR扩增，引物由上海生物工程公司合成。PCR反应体系(25 μL)：ddH2O 10 μL、2×PCRTaq混合物12.5 μL、DNA模板0.5 μL、上下游引物各1.0 μL(20 μg/μL)。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，40个循环；最后72 ℃延伸7 min。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。采用快捷型琼脂糖DNA回收试剂盒(天跟生物科技公司)回收纯化PCR扩增产物，并将其与pEASY-T5(北京全式金生物技术有限公司)进行连接转化，每个分离物挑选6个经PCR鉴定为阳性的克隆，送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。所得测序结果在GenBank中进行blastn比较搜索，确定病原分类地位，并用DNAMAN进行多序列比对分析。应用MEGA 6.0[19]软件，以Coleosporiumasterum(HQ31750) 和Melampsorasp.(GU058014)为外群，采用邻接法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病害症状

云南勐海海引1号4份甘蔗锈病样品的病斑聚集呈簇，长3～8 mm，宽1～2 mm，夏孢子堆桔黄色(图1-A)，为典型黄锈病症状特征；其余53份甘蔗锈病样品的病斑分散，长10～30 mm，宽1～3 mm，夏孢子堆棕红色(图1-B)，为典型褐锈病症状特征。

2.2 病原形态特征

云南勐海海引1号4份甘蔗锈病样品的夏孢子梨形，栗褐色或金黄色，表面有刺，壁顶端加厚10 μm以上，大小为(25～50)μm × (16～35)μm，具4～5个芽孔，无侧丝(图1-C)，为屈恩柄锈菌夏孢子。其余53份甘蔗锈病样品的夏孢子球形，棕色至深棕色，表面密布小刺，壁四周均匀加厚，大小为(20～40)μm × (13～25)μm，芽孔多4个；侧丝较多，无色，匙形(图1-D)，为黑顶柄锈菌夏孢子。

A：甘蔗黄锈病叶部症状；B：甘蔗褐锈病叶部症状；C：屈恩柄锈菌夏孢子形态特征；D：黑顶柄锈菌夏孢子形态特征A: Leaf symptoms of sugarcane orange rust disease; B: Leaf symptoms of sugarcane brown rust disease; C: Urediospores morphological characteristics of P. kuehnii; D: Urediospores morphological characteristics of P. melanocephala图1 甘蔗锈病田间症状及其病原菌的显微形态特征Fig.1 Field symptoms of sugarcane rust diseases and morphological characteristics of their pathogens

2.3 病原分子鉴定

提取的甘蔗锈病病叶DNA经扩增、测序后将所得序列(GenBank登录号见表1)提交NCBI网站进行BLAST同源性比较分析。结果表明：云南勐海海引1号4份甘蔗锈病病原的核苷酸序列(GenBank登录号：KP201840～KP201843)与已报道的屈恩柄锈菌核苷酸序列(GenBank登录号：GU058021)同源性在99.9%以上，表明该病原是屈恩柄锈菌(表1)；云南保山、临沧、勐海、孟连、西盟、澜沧和文山其他甘蔗品种上的53份甘蔗锈病病原核苷酸序列(GenBank登录号：KP201824～KP201839，KU886334～KU886368，MZ188978～MZ188979)与已报道的黑顶柄锈菌核苷酸序列(GenBank登录号：GU058001)同源性在99.8%以上，表明该病原是黑顶柄锈菌(表1)。

2.4 系统进化分析

从GenBank中搜索并下载甘蔗锈病病原及其他柄锈菌的rDNA序列，与本研究获得的57条甘蔗锈菌序列一起构建NJ系统进化树。结果(图2)表明，本研究获得的57条甘蔗锈菌rDNA序列与其他柄锈菌，在整个系统进化树中分为4组。其中，53条黑顶柄锈菌与GenBank中已报道的黑顶柄锈菌核苷酸序列(GenBank登录号：GU058001、JX036025和MG564638)，及P.nakanishikii(GenBank登录号：GU058002)、P.rufipes(GenBank登录号：AJ29654 5)、Aecidiumdeutziae(GenBank登录号：KU309317)和P.coronata(GenBank登录号：DQ354526) 等柄锈菌属锈菌聚为组1。4条屈恩柄锈菌与GenBank中已报道的屈恩柄锈菌核苷酸序列 (GenBank登录号：GU0580021)和P.polysora(GenBank登录号：GU058024)聚为组4；黄褐锈病病原M.fulvasp.nov.(GenBank登录号：JX036026和JX036027)与P.physalidis(GenBank登录号：DQ354522)、P.sparganiodis(GenBank登录号：GU058027)和Pucciniosirapallidula(GenBank登录号：DQ354534) 聚为组3；而其余的GenBank中已报道的柄锈菌属其他锈菌聚为组2。

图2 基于甘蔗锈菌与其他柄锈菌属锈菌rDNA序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on rDNA sequence of sugarcane rust fungi and Pucciniaceae fungi from GenBank

3 讨 论

甘蔗锈病菌与柄锈菌属其他锈菌rDNA序列系统进化分析结果显示低纬高原云南蔗区53个黑顶柄锈菌分离物在系统进化树中无明显的品种和地理分组，说明这53个黑顶柄锈菌分离物间无分子变异或变异较小。本研究中用于分析的所有黑顶柄锈菌分离物与柠檬草锈菌P.nakanishikii的遗传关系最近，而与甘蔗锈病的另一病原屈恩柄锈菌的遗传关系较远，这与Dixon等[20]对来自23个国家164个蔗区的甘蔗锈菌分离物与其他锈菌的系统进化关系分析结果一致。

虽然甘蔗黄锈病的病原屈恩柄锈菌是一种突发性病原，但一旦该病爆发常造成巨大的经济损失。因甘蔗黄锈病的发生，每年澳大利亚和美国佛罗里达的经济损失超过17.7亿美元和4亿美元[20-21]，严重阻碍了当地蔗糖业的持续稳定发展。甘蔗锈病的发生流行与品种抗病性紧密相关，感病品种的大面积种植是病害流行的重要原因，利用抗病品种是防治最经济有效的措施。云南是中国甘蔗野生资源重要的分布中心和世界野生甘蔗起源中心之一，且因复杂多样的地理及气候条件形成了丰富的甘蔗种质资源，是中国乃至世界甘蔗遗传改良的天然宝贵基因库之一[22]。然而，至今中国甘蔗种质资源和品种材料抗锈病的鉴定与评价，仅针对褐锈病[23-24]，黄锈病的抗病鉴定与评价尚未开展。今后在开展褐锈病优良抗源材料和抗病品种评价筛选的同时，还应加强黄锈病优良抗源材料和抗病品种的评价筛选，以期为选育和利用抗病品种有效防控甘蔗锈病提供科学依据和优良抗源材料。

由M.fulvasp.nov.引起的甘蔗黄褐锈病是2008年在斯威士兰甘蔗品种N25上发现的一种新型甘蔗锈病。其病斑线形，平行于中脉，长约2～10 mm。夏孢子堆新鲜时为亮橙色，随后变为深红棕色，长度可达3 mm。夏孢子椭圆形、倒卵形或球形；亮橙色至橙红色；壁四周均匀加厚，厚度为1.5～4.9 μm；大小为(25～32)μm ×(20～26)μm[7]。目前，该病在斯威士兰和南非蔗区普遍发生为害。2016年在莫桑比克和津巴布韦的芒草上也观察到与甘蔗黄褐锈病一样的症状[4]。因此，应加强引种检疫及甘蔗和可作为替代寄主的芒属或其他相关杂草锈病的监测，从源头上防止甘蔗黄褐锈病传入中国，有效减少该病对蔗糖产业的潜在威胁，以促进中国蔗糖产业的高质量发展。

4 结 论

本研究采用形态学观察和分子鉴定方法，通过对云南保山、临沧、勐海、孟连、西盟、澜沧和文山等蔗区采集到的57份甘蔗锈病病原进行检测和序列分析，首次在云南勐海蔗区发现引起甘蔗黄锈病的屈恩柄锈菌，并证实引起褐锈病的黑顶柄锈菌是主要病原菌。这为中国甘蔗锈病的深入研究和科学防控奠定了基础、提供了依据。