水稻EMS诱变根系突变体的筛选及其农艺性状分析

陈 开，陈宇峰，封昱均，唐 瑭，杨 超，华 夏，张冬平，陈 云，吕 冰

(1. 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室, 扬州大学生物科学与技术学院, 江苏 扬州 225009；2. 淮阴师范学院生命科学学院, 江苏 淮安 223300)

【研究意义】水稻是世界三大粮食作物之一，是影响我国农业生产和经济发展的重要作物。在当前面临全球性的气候变化和人口增长困境下，培育高产稳产的优质作物种质已经成为了解决粮食问题的关键[1]。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methanesulfonate，EMS)是一种强效化学诱变剂，被广泛地应用在水稻的诱变育种工作中[2-4]。新时代背景下，现代农业面临全新的挑战：提高粮食安全和减少环境影响，而根系育种的研究有望解决这一问题[5]。水稻根系是极为重要的地下部分，其发育状况会直接影响水稻地上部分产量[6]。通过EMS诱变技术构建水稻突变体库，针对水稻根系突变体筛选具有各类优良农艺性状的水稻株系，为优质高产水稻种质的育种和相关研究的开展提供优良亲本材料。【前人研究进展】水稻成株根系短小且不发达，地上部分穗数会较多；成株根系较为发达，株高会较高，穗型较大，穗粒数也较多等[7]。同时，在水稻根系育种过程中，幼苗的根系与成株根系发育关系较为密切，并且可以较好地进行连续观测和便于调控，因此被广泛应用于高效筛选优良根系性状的育种工作[1,8]。但当前对于水稻根系性状与其生理功能关系及其对水稻整体发育影响的研究仍处在较初级阶段，需要深入地研究与分析以整合地下部分与地上部分的关系[9]，从而进一步开展水稻根系育种，改良水稻的品种特性和提高产量。武运粳8号是江苏省武进市农科所选育的常规粳稻，1999年通过江苏省品种审定并正式命名，具有综合性状良好，产量较高等优点[10]。【本研究切入点】本实验利用EMS诱变技术对武运粳8号的种子进行诱变处理，经过多代培养和筛选EMS突变株系，对其根系表型和农艺性状进行分析。【拟解决的关键问题】此研究拟深入调查分析水稻根系突变后代多样性和群体变异情况，整理归纳水稻根系性状与其生理功能的关系，强化根系发育对植株表型和作物产量影响的认知，并为进一步改良和利用武运粳8号水稻品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料种植

试验材料为经1%EMS诱变剂处理的武运粳8号(W8)水稻种子，由扬州大学张冬平博士提供。

2018年5月，将EMS诱变水稻及其野生型W8水稻种子种植于大田，成熟后按单株收获M1代种子。将M1代收获种子较多的水稻株系除留种外，取部分种子用于根系性状初步筛选，其余种子数目较少的株系种子南繁加代。

2019年5月，将根系性状初步筛选获得的M1代突变体种子、南繁收获的M2代种子和野生型W8种子播种大田，每株种子播种1行，共594个株系，灌浆期测量田间植株表型和农艺性状，对比W8从各诱变株系中进行变异单株的筛选，获得存在变异表型的5株M2代和9株M3代单株水稻种子。5株经过初期筛选的株系的M2代分别为RM1、RM2、RM3、RM4和RM5，9株M3代株系分别命名为RM6、RM7、RM8、RM9、RM10、RM11、RM12、RM13、RM14。

2020年6月播种上一年单株收获的各突变株系和野生型W8种子，每株系种子种植3行。试验地为扬州大学水稻试验田，行长1.8 m，每行10株，行距0.2 m，株距0.2 m。田间管理按照正常大田生产，进行除杂草、补田水和施肥等日常维护工作，期间未发生大规模倒伏和相关病虫害。

1.2 农艺性状与单株产量测量

在水稻灌浆期前后开始调查各突变株系的田间农艺性状，各株系分别调查3行，每行调查8株，取8株性状数据平均值进行分析。农艺性状指标包括株高、穗长、旗叶长、有效分蘖数、每穗粒数、实粒数、百粒重、籽粒长度、籽粒宽度和单株产量。

株高(cm)：测量从地面至稻穗顶部距离，不包括芒；穗长(cm)：测量自穗轴基部至穗顶端长度，不包括芒；旗叶长(cm)：取水稻最上方一片叶，测量自叶基部至叶顶端长度；有效分蘖数(个)：计数单株已抽穗分蘖的数目；每穗粒数(个)：每株系水稻取10穗，脱粒后计数，计算平均值；实粒数(个)：将脱粒后的10穗种子中的空瘪种子除去，计数剩余实粒种子，计算平均值；百粒重(g)：将水稻种子脱粒烘干后，每个材料随机取100粒种子，称重记录，重复10次，计算平均值；籽粒长度：每个材料随机取10粒种子，直线排列测量种子总长，计算单粒粒长，重复10次，计算平均值；籽粒宽度：每个材料随机取10粒种子，直线排列测量种子总宽，计算单粒粒长，重复10次，计算平均值；单株产量(g)：根据文献[11]方法，将各材料的每穗籽粒重量乘以单株有效分蘖数，得到各材料的单株产量。

1.3 幼苗根系性状测量

将水稻种子室温浸种24 h后，放置于37 ℃恒温培养箱中催芽24 h。随后将露白种子种在96孔板中，放置于遮光处理的含有1/4营养液的培养盒上，在光照培养箱中生长7 d(光照/黑暗，16 h/8 h，28 ℃/25 ℃，湿度75%)。使用根系扫描仪扫描7天龄幼苗根系获取扫描图像，图像使用“万深”图像分析软件处理，获取包括总根长(cm)、总根尖数(个)、根表面积(cm2)、根投影面积(cm2)和平均直径(mm)等数据用于分析。

1.4 数据整理和分析

试验数据都采用Microsoft Office Excel 2019进行记录和整理。对各农艺表型和根系性状数据进行简单分析、单因素方差分析、LSD(Least Significant Difference)多重比较分析、聚类分析和多维偏好分析。数据分析采用IBM SPSS Statistics 24.0软件。绘图使用Microsoft Office PowerPoint 2019和GraphPad Prism 8。

2 结果与分析

2.1 EMS突变株系表型分析

各EMS突变株系的水稻7 d龄幼苗根系表型与野生型W8存在差异(图1-A)，其中RM2和RM13的幼苗根系表型相对于W8更为发达，尤其是RM2，其总根长超过W8达到21.7%以上。而RM3株系根系相对于W8根长较短，仅有W8的70.4%，并且其幼苗根系在自然状态下出现局部扭曲和螺旋化(图1-A中RM3箭头所指处)。统计分析表明，突变株系中总根长、总根尖数、根表面积、根投影面积和根平均直径(图1-B～图1-F)等性状指标上均存在与W8差异显著或极显著的材料。总根长上，突变株系RM3显著小于W8；在总根尖数上，RM3同样显著小于W8，而RM13显著大于W8；在根表面积和根投影面积上，RM1、RM3、RM6显著小于W8；在根平均直径上，有5份材料显著小于W8，其中RM1和RM7极显著小于W8。

A: EMS突变株系7 d龄水稻幼苗根系表型代表图，图中黑色箭头指向为RM3幼苗根系扭曲和螺旋化部位; B:总根长; C:总根尖数; D:根表面积; E:根投影面积; F:根平均直径。表型图中突变株系是各聚类类群代表，各根系性状指标图中列出了表型图中突变株系，同时列出了其他与W8存在显著差异的突变株系的数据，*表示0.05显著水平，**表示0.01显著水平，下同A: Root phenotypes of 7-day-old rice seedlings of EMS mutagenic lines, the black arrow pointed to the twisted and spiral parts of root system of RM3; B: Total root length; C: Total number of root tips; D: Root surface area; E: Root projection area; F: Average diameter of root. The mutagenic lines were the representatives of each cluster group. The mutagenic lines were listed in the diagram of root traits index, and the data of other mutagenic lines significantly different from W8 are listed, * indicated significantly correlated at the 0.05 level, * * indicated significantly correlated at the 0.05 level, the same as below图1 EMS突变株系水稻幼苗根系表型与农艺性状Fig.1 Phenotypic and agronomic traits of seedling roots of EMS mutagenic lines

各EMS突变株系水稻成株表型与W8同样存在差异(图2-A)。突变株系中RM5、RM10和RM13相对于W8株高较高。其中RM10最高，超过W8达到13.4%以上，且RM10的有效分蘖数也超过W8达到37%以上。而RM3较矮，仅有W8的84.6%。统计分析表明，突变株系的株高和有效分蘖数(图2-B～图2-C)等指标上存在与W8差异显著或极显著的材料。在株高上，RM3极显著小于W8，RM11和RM12显著大于W8，RM5、RM10和RM13极显著大于W8；在有效分蘖数上，RM4显著小于W8，RM14极显著小于W8，RM10极显著大于W8。

A: EMS突变株与W8的成株表型; B:株高; C:有效分蘖数A: Phenotypes of adult plants of EMS mutagenic lines and W8; B: Plant height; C: Number of effective tillers图2 EMS突变株系水稻成株表型与农艺性状Fig.2 Phenotypic and agronomic traits of adult plants of EMS mutagenic lines

各突变株系水稻的稻穗表型与W8也存在差异(图3-A)。突变株系中RM13和RM14相比于W8穗长较短，RM3穗长与W8穗长相近，这3份突变株系的穗粒数都与W8相近，而RM4和RM11相比于W8穗长较长，其中RM4超过W8达到10%以上，同时穗粒数也超过W8达到10%以上。EMS突变株系籽粒与W8表型存在差异(图3-B～图3-C)。突变株系中RM1、RM3和RM13的籽粒长度相比于W8较长，RM10的籽粒长度最短，RM3籽粒宽度与W8接近，RM5籽粒宽度最小。统计分析表明，突变株系中穗长、每穗粒数、实粒数、百粒重、籽粒长度、籽粒宽度和单株产量(图3-D～图3-J)等性状指标上均存在与W8差异显著或极显著的材料。在穗长上，RM4显著大于W8，RM14显著小于W8；在每穗粒数和实粒数上，RM1显著小于W8；在百粒重上，RM2显著大于W8，RM14显著小于W8，RM4、RM8和RM10极显著小于W8；在籽粒长度上，有6份材料显著或极显著大于W8，RM10极显著小于W8；在籽粒宽度上，有7份材料极显著小于W8；在单株产量上，RM9显著大于W8，RM10和RM11极显著大于W8，RM1显著小于W8，还有6份材料极显著小于W8。

A: EMS突变株系与W8的稻穗表型; B: EMS突变株系与W8的籽粒长度表型; C: EMS突变株系与W8的籽粒宽度表型; D:穗长; E:每穗粒数; F:实粒数; G:百粒重; H:籽粒长度; I:籽粒宽度; J:单株产量A: Phenotypes of spikes of EMS mutagenic lines and W8; B: Phenotypes of grain length of EMS mutagenic lines and W8; C: Phenotypes of grain width of EMS mutagenic lines and W8; D: Panicle length; E: Number of grains per panicle; F: Number of filled grains; G: 100-grain weight; H: Grain length; I: Grain width; J: Yield per plant图3 EMS突变株系水稻稻穗与籽粒表型与农艺性状Fig.3 Phenotypic and agronomic traits of panicles and seeds of EMS mutagenic lines

2.2 EMS突变株系农艺性状分析

由表1可知，EMS突变株系材料间各农艺性状变异较为丰富。突变株系7 d龄幼苗的总根长平均值为67.57 cm，极差34.33 cm，有6份突变株系的总根长超过W8(67.02 cm)，其中突变株系RM2的总根长最长，达到81.53 cm，而RM3的总根长最短，仅有47.2 cm。突变株系总根尖数均值为223个，极差188个，共6份材料总根尖数超过W8(212个)，其中RM13的总根尖数最多，为313个，而RM3的总根尖数最少，仅有125个。突变株系根表面积和根投影面积的平均值分别为8.57与2.73 cm2，其中RM5的数值最大，为10.25和3.26 cm2，而RM6最小，仅有7和2.23 cm2。突变株系的根平均直径均值为0.44 mm，群体中根平均直径大于W8(0.44 mm)的占71.4%，其中RM3的根平均直径最大，达到0.53 mm，而RM7最小，仅有0.37 mm。突变株系株高的平均值为91.47 cm，极差为26 cm，有12份突变株系株高高于野生型W8(90.00 cm)，占85.7%，其中RM10的株高最高，达到102.10 cm，而RM3的最低，为76.10 cm。突变株系旗叶长的平均值为23.22 cm，其中RM5最长，达到25.80 cm，而RM1最短，仅有21.20 cm。突变株系的有效分蘖数均值为6个，其中RM11有效分蘖数为8个，RM10最多，达到9个。突变株系穗长的平均值为16 cm，极差为3.10 cm，有7份突变株系穗长超过W8(16.10 cm)，其中RM4的穗长最长，为17.70 cm。突变株系每穗粒数的平均值为143粒，极差为36粒，有5份突变株系每穗粒数多于W8(144粒)，RM4、RM9和RM11每穗粒数都在154粒上，RM9每穗粒数最多，达到161粒。突变株系实粒数的平均值为136粒，有4份突变株系实粒数大于W8(139粒)，其中RM4、RM9和RM11实粒数达到148粒以上，其中RM9实粒数最多(155粒)，其实粒率也最高，达到96.27%。突变株系百粒重的平均值为3.04 g，有7份突变株系的百粒重大于W8(3.06 g)，其中RM2百粒重最大，为3.18 g。突变株系籽粒长度平均值为7.78 mm，有10份突变株系籽粒长度大于W8(7.75 mm)，其中RM3最大，为8.10 mm，而RM10最小，仅为7.22 mm。突变株系籽粒宽度平均值为3.55 mm，其中RM10最大，为3.73 mm，而RM5最小，仅为3.41 mm。突变株系单株产量的平均值为27.24 g，极差为21.71 g，有4份突变株系单株产量大于W8(29.82 g)，RM10和RM11的单株产量都超过35 g，其中RM11最大，为37.16 g，超过W8产量7.34 g。

表1 表1 EMS突变株系的农艺性状Table 1 Agronomic traits of EMS mutagenic lines

突变株系各性状按变异系数从大到小依次为：单株产量、总根尖数、有效分蘖数、总根长、根表面积、根平均直径、根投影面积、实粒数、每穗粒数、旗叶长、株高、穗长、籽粒宽度、百粒重、籽粒长度。变异系数大于20%的有单株产量和总根尖数，表明这些性状受到EMS诱变效果的影响较大，因而变异类型较为丰富。变异系数小于10%的有实粒数、每穗粒数、旗叶长、株高、穗长、籽粒宽度、百粒重和籽粒长度，表明这些性状受到EMS诱变效果影响较小。综上可知，EMS诱变使得武运粳8号水稻突变株系获得了丰富的农艺性状变异，提供了较多可供筛选优质种质的材料。

2.3 EMS突变株系农艺性状指标的相关性分析

对突变株系的5个幼苗性状、6个农艺性状、3个籽粒性状以及单株产量进行了简单相关性分析(表2)。发现多数农艺性状之间达到显著或极显著相关。其中，幼苗总根长与总根尖数极显著正相关；总根长与根平均直径极显著负相关；总根长与穗长显著负相关。总根尖数与根平均直径极显著负相关；总根尖数与穗长显著负相关。根表面积与根投影面积极显著正相关。株高与有效分蘖数显著正相关。有效分蘖数与单株产量极显著正相关。穗长与每穗粒数和实粒数极显著正相关。每穗粒数与实粒数极显著正相关。籽粒长度与株高极显著负相关。以上结果表明突变株系的这些性状之间存在着紧密的联系。

表2 EMS突变株系农艺性状之间的简单相关性分析Table 2 Simple correlation coefficients of agronomic traits of EMS mutagenic lines

2.4 EMS突变株系聚类分析

由图4可知，经过系统聚类将14份突变株系与W8聚成5类。类Ⅰ包含W8与5份材料，类Ⅱ为RM4与RM9两份突变株系，类Ⅲ包含5份材料，类Ⅳ和类Ⅴ都只有1份突变株系，分别为RM13和RM3，且聚类距离最远，说明RM13和RM3两个突变株系的农艺性状明显区别于其他材料。

实心圆指突变株，空心圆指W8；罗马数字表示下方加粗线段包含的突变株及W8所在类群。类Ⅰ包含RM6、RM12、W8、RM11、RM8和RM10；类Ⅱ包含RM4和MR9；类Ⅲ包含RM1、RM5、RM7、RM2和RM14；类Ⅳ包含RM13；类Ⅴ包含RM3Solid circles represented EMS mutagenic lines, hollow represented W8; Roman numerals indicated the group of mutagenic lines and W8 contained in the bold line below. Class I included RM6, RM12, W8, RM11, RM8 and RM10; Class II included RM4 and mr9; Class III included RM1, RM5, RM7, RM2 and RM14; Class IV included RM13; Class V included RM3图4 EMS突变株系系统聚类Fig.4 Phylogenetic clustering of EMS mutagenic lines

由表3可知，各类群突变株系的农艺性状存在差异。W8所在的类Ⅰ有效分蘖数最多，单株产量也最高，达到31.22 g，表明有效分蘖数对单株产量的有较大影响。类Ⅱ幼苗的根表面积和根投影面积最大，分别为8.77和2.79 cm2，同时成株旗叶长和穗长最长，分别为23.63和17.51 cm，每穗粒数和实粒数都最多，为159.50和151.90粒，但百粒重最低，仅有2.97 g，同时籽粒长度最短，仅有7.64 mm。类Ⅲ的幼苗总根长最长，但每穗粒数最低，仅有134.40粒，籽粒宽度也最短。类Ⅳ的总根尖数最多，株高最高，为94.74 cm，抗倒伏性较弱，穗长最短，同时实粒数最低，仅125.20粒，单株产量也最低，为22.66 g。类Ⅴ的总根长、总根尖数、根表面积和根投影面积都最低，但根平均直径最高，呈现为根系表型短粗，同时株高最低，仅有76.08 cm，抗倒伏性强，旗叶长最短，有效分蘖数最低，为5.63个，籽粒长度和籽粒宽度都最长，达到8.10和3.68 mm。

表3 各类群突变株系的农艺性状分析Table 3 Agronomic traits of the mutagenic lines between different clustering groups

3 讨 论

构建水稻突变体库为水稻性状的改造以及遗传育种的研究奠定了重要基础。利用EMS诱变技术处理来获得突变体和新型种质已经成为一种较为成熟且有效的手段。本研究利用EMS处理了水稻品种武运粳8号的种子，经筛选后共获得存在根系变异表型的5株M2代和9株M3代单株水稻突变体材料，对其的表型观察表明，在幼苗根系、成株、稻穗与籽粒等性状上都有突变体材料与W8存在较为明显的差异。

数据分析表明，突变株系群体变异丰富，与W8在总根长、总根尖数、根表面积、根投影面积、根平均直径、株高、有效分蘖数、穗长、每穗粒数、实粒数、百粒重、籽粒长度、籽粒宽度和单株产量等性状指标上存在显著差异，在突变株系中有85.7%的株系株高超过W8，有71.4%的株系籽粒长度超过W8，有64.3%的株系旗叶长超过W8，有50%的株系百粒重超过W8，同时还有42.9%的株系在总根长、总根尖数和穗长上都超过W8，表明1% EMS诱变对于水稻株高、旗叶长、百粒重、总根长、总根尖数、穗长和籽粒长度上都有较好的正向诱导效果。

相关性分析表明，水稻突变株群体成株的单株产量主要与有效分蘖数、穗长、每穗粒数、实粒数和百粒重正相关，与Ranawake等[12]和Luz等[13]研究结果一致，其中有效分蘖数与单株产量呈极显著正相关，对产量影响较为明显，同时成株穗部性状也与产量密切相关[14-15]，其中较为重要的每穗粒数与实粒数均与穗长显著正相关，与周倩倩[15]研究结果一致。这表明在今后的武运粳水稻育种工作中，可通过适当提高植株分蘖数与穗长以进一步改良武运粳水稻的单株产量。

此外，水稻突变株群体7 d龄幼苗根系性状相关性分析表明，根平均直径与单株产量呈正相关，而总根长、总根尖数、根表面积和根投影面积与单株产量呈负相关，这与宫殿凯等[16]的研究结果一致。幼苗根系总根长与总根尖数极显著正相关，与根表面积和根投影面积都正相关，而与根平均直径极显著负相关，表明幼苗根系往往会呈现出长根细，短根粗的表型，在之后的武运粳8号水稻的育种工作中，筛选幼苗时根系表型更为粗短的材料对提高产量有较大的作用。同时，水稻幼苗培育更为简单可控，观测更为便捷高效，因而本文所提供的幼苗培育及筛选方法，也可为进一步优化水稻高产育种技术提供一定的帮助。

为更进一步了解武运粳8号突变株系与W8在农艺性状上的关系，以更好的进行育种研究，本实验将所获取的突变株系与W8进行多维偏好分析(图5)。综合考虑各类材料，其中类Ⅰ的RM11和类Ⅱ中RM9材料的综合性状较为优越，其有效分蘖数较多、长穗、每穗粒数、实粒数和单株产量都较高，是相对理想的高产水稻育种材料。类Ⅰ中RM10高产高杆，是饲料型材料育种的理想材料；类Ⅲ中RM14幼苗根系较为发达，适用于研究水稻幼苗早期根系发育调控，以及培育适应交替湿润干燥条件的高产稻的理想根系构型[1]；类Ⅳ(RM13)空瘪率较高，可用于研究调控水稻灌浆的功能基因调控；类Ⅴ(RM3)株高较低，百粒重和籽粒长宽都较高，是作物矮化育种和大粒品种育种的理想材料。此外，RM3株系与此前Jiang等[17]研究的OsRMC(Oryzasativaroot meander curling)相关的水稻弯卷曲根突变体表现类似。OsRMC参与茉莉酸(Jasmonic acid, JA)信号转导，介导水稻根系发育并负调控根系卷曲，后续研究表明OsRMC受到两种ERF(Ethylene-response factor)转录因子OsEREBP1(Ethylene-responsive element binding protein1)和OsEREBP2的调控，OsHOS1(High expression of osmotically responsive gene1)可降解这两种转录因子进而影响OsRMC的作用[18]。但不同的是Jiang等[17]研究的OsRMC突变体根系在暗培养下根系只会出现小幅度弯曲，根系发育并未受明显影响，而本实验发现的RM3突变体根系在暗培养下依然出现了较为明显的扭曲和螺旋，且相比于W8根系发育显著弱势，这表明RM3根系发育突变体很可能是研究水稻根系JA调控和机械感应与应答的良好材料。在今后的育种工作中，这些水稻突变体可作为优良亲本，可依据其不同变异性状对其进行育种的利用和开展相关研究。

圆点越靠近性状向量，表示圆点代表的株系在该性状上表现越明显，圆点在性状向量指向的方向延伸越远，表示圆点代表的株系在该性状上超出群体平均值越大The closer the dot was to the trait vector, the more obvious the performance of the EMS mutagenic line on the traits, and the further the dot extends in the direction of trait vector, indicating that the line exceeds the population average value on the trait the more the line exceeded the average图5 EMS突变株系多维偏好分析Fig.5 Multidimensional preference analysis of EMS mutagenic lines

4 结 论

利用EMS诱变技术处理武运粳8号水稻种子，对其M2和M3突变株系群体的苗期根系表型和成株农艺性状进行分析与评价。结果表明1% EMS诱变对于水稻株高、旗叶长、百粒重、总根长、总根尖数、穗长和籽粒长度上都有较好的正向诱导效果，可适当提高植株有效分蘖数与穗长以进一步改良武运粳水稻的单株产量。此外水稻幼苗根系发育在总体上与单株产量呈负相关，但结果并不显著，选育苗期根系表型更为粗短的材料对提高产量也有一定作用。筛选获取了6份相对理想的育种与实验材料，其中RM3突变株系表型特殊，且该表型多代稳定保持，很有可能是研究水稻根系JA调控和机械感应与应答的良好材料。