PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA 重组干扰质粒的构建及鉴定

闫 琦，丁 航，王文强，3，侯 敢，*（.广州市红十字会医院，广东广州 5000；.广东医科大学，广东东莞 53000；3.广东省妇幼保健院，广东广州 5000.）

Survivin 是凋亡蛋白抑制因子家族（inhibitor of apoptosis proteins,IAPs）中凋亡抑制作用最强的因子，具有抑制肿瘤细胞凋亡、促进细胞增殖和肿瘤间质血管形成的作用，目前已成为肿瘤早期诊断和治疗的新靶点[1]。RNA 干扰（RNA interfere，RNAi）是指双链 RNA（double‐stranded RNA，dsRNA）诱导的、保守的、同源 mRNA 降解的现象，目前广泛应用于肿瘤及癌症治疗研究[2]。本研究依据RNAi 原理，合成针对人Survivin 基因的shRNA，选择人类肺腺癌细胞株A549为研究对象，在mRNA 水平和蛋白表达水平检测Survivin 基因表达水平的变化，为进一步研究Survivin基因在肿瘤治疗中的作用提供载体工具。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要试剂

人肺腺癌细胞（A549）由广东医科大学生化教研室提供。PGP‐U6‐GFP‐neo 质粒由上海吉玛公司提供。兔源Survivin（N111）pAb 一抗及P‐山羊抗兔IgG 抗体二抗均购自Bioworld 公司，FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒与SYBR Green Real time PCR Master Mix 购自天根公司。Trizol RNA 分离试剂、脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen 公司。DNA Extraction Kit Ver.5.0 购自Takara 公司。EZ DNA Methylation‐Gold KitTM 购自Zymo Research 公司。PCR 引物上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 shRNA 干扰序列的设计合成 本实验共设计了4 个针对Survivin 基因的干扰靶点，如表1。待插入的空质粒带有Bam HⅠ和BbsⅠ酶切位点。用T4 连接酶把经过双酶切的质粒和干扰靶点连接到一起，构建PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐1、PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐2、PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐3、PGP‐U6‐GFP‐neo‐ survivin‐shRNA‐4 重组质粒，简称shRNA‐1、shRNA‐2、shRNA‐3、shRNA‐4。

表1 针对Survivin 基因的4 个干扰靶点

1.2.2 细胞培养与转染 用含有10%(体积分数）胎牛血清的OPTI‐MEM 培养液置于37 ℃，5%(体积分数）CO2培养箱中常规培养人肺腺癌细胞株A549 细胞，取对数生长期的细胞用于实验。将细胞以4×105个细胞/孔的密度接种六孔板。实验设置5 组：shRNA‐1组、shRNA‐2 组、shRNA‐3 组、shRNA‐4 组、空白对照组。每组设3 个复孔。采用Invitrogen 公司的脂质体LipofectamineTM2000 介导质粒转染细胞，144 μL无血清培养基加入6 μL LipofectamineTM2000（总体积150 μL）室温静置5 min，145 μL 无血清培养基加入3 μg 质粒（总体积150 μL）。混合质粒DNA 和LipofectamineTM2000 的稀释液（共300 μL）。轻轻混匀并在室温下静置20 min。将混合液300 μL 均匀的加入平板中，未转染的空白对照组加入300 μL OPTI‐MEM 培养液。4 h 后换液，换入含血清但不含双抗的1640 培养液，继续培养，48 h 时收集细胞。

1.2.3 Survivin mRNA 表达的检测 转染48 h，Trizol法提取总RNA，用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录合成cDNA。Survivin 正向引物 P1:5'‐TGACGACCCCATA GAGGAACA‐3'，Survivin 反向引物P2:5'‐CGCACTT TCTCCGCAGTTTC‐3'，GAPDH 正向引物P3:5'‐AGG GGTCTACATGGCAACTG‐3'，GAPDH 反向引物P4:5'‐CGACCAC TTTGTCAAGCTCA ‐3'。按照SYBR Gr een Real Time PCR Master Mix 说明书，PCR 总反应体系为20 μL，其中含2×Super Real PreMix12.5 μL，Prim er1（10 μmol/L）0.5 μL，Primer2（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 模板2 μL，RNase Free dH2O 4.5 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共27 个循环。实验重复3次。由PCR 反应曲线得到阈值循环数（Ct），以GAPDH为内参，计算目的基因相对表达量（RQ 值）=2‐△△Ct。使用Graphpad prim8.3 软件进行分析，抑制率=（空白对照组相对值-重组质粒组相对值）/空白对照组相对值×100%，取3 次结果进行统计分析。

1.2.4 Western Blot 检测细胞总蛋白中Survivin 的表达情况 转染72 h 后，将对数生长期的5 组细胞按蛋白抽提要求进行处理，测定蛋白浓度后，将样品用细胞裂解液稀释为同一浓度，进行SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件：浓缩胶电压80 V，30 min，分离胶电压120 V，1 h，随后将分离的蛋白质恒流60 V 转移60 min 转至PVDF 膜上。在室温摇床上用20 mL 含5%脱脂奶粉的TBST 封闭1 h，将PVDF 膜完全浸泡在溶液中。室温摇动封闭3 h。将一抗（兔抗人survivin）用一抗稀释液稀释1∶500，4 ℃摇床孵育过夜，PBS 洗膜3 次。二抗（山羊抗兔IgG‐HRP）稀释1∶5 000，放入抗体孵育盒中并与膜接触。温和摇动，室温孵育1 h。再用PBS 洗膜3 次，最后在暗室进行显影定影，以GAPDH作为内参，结果灰度值使用Quantity One 软件进行分析。抑制率=（空白对照组灰度相对值－重组质粒组灰度相对值）/空白对照组灰度相对值×100%，取3 次结果进行统计分析。

1.3 统计学处理

所有计量资料以表示。数据采用GraphPad Prime 8.3 软件、Quantity One 软件和SPSS 26.0 软件进行处理，多组均数之间比较采用单因素方差分析及q检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组shRNA 表达质粒的DNA 测序结果

成功的向重组质粒中插入了设计的shRNA 的片段，从测序结果（图1～4）可以看到插入的碱基序列与设计shRNA 的片段的完全一致。（1）PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐1 部分测序结果（划线部分表示插入序列）见图 1；（2）PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐2部分测序结果（划线部分表示插入序列）见图 2；（3）PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐3 部分测序结果（划线部分表示插入序列）见图 3；（4）PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐4 部分测序结果（划线部分表示插入序列）见图 4。

图1 PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐1 插入序列部分测序图

图2 PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐2 插入序列部分的测序图

图3 PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐3 插入序列部分的测序图

图4 PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐4 插入序列部分的测序图

2.2 转染A549 细胞中GFP 的表达

转染48 h 后，在荧光显微镜下观察A549 细胞中GFP 的表达见图5。

图5 转染48 h 后荧光显微镜观察A549 中GFP 的表达

2.3 A549 细胞Survivin mRNA 表达

内参基因和目的基因扩增曲线指数增长期平行，扩增效率基本一致，且溶解曲线为单一峰值，结果采用=2‐△△Ct进行分析。转染48 h 后，荧光定量PCR 进一步精确检测A549 细胞Survivin 基因mRNA 的表达，结果见表2。与空白对照组相比较，转染干扰质粒组表达量降低非常明显（P<0.01），其中转染PGP‐U6‐GFP‐neo‐Survivin‐shRNA‐2 质粒组Survivin mRNA 抑制更为明显。

表2 转染48 h 后survivin mRNA 相对表达量（,n=30）

表2 转染48 h 后survivin mRNA 相对表达量（,n=30）

与空白对照比较：aP<0.01

2.4 Western blotting 检测转染细胞Survivin 蛋白的表达

转染72 h 后，Western blotting 检测A549 细胞Survivin 蛋白的表达情况见图6，与空白对照组相比较，转染干扰质粒组表达量均有不同程度的降低。Survivin目的蛋白的大小为16.5 kD，以GAPDH 蛋白作为内参，大小为36 kD。

图6 Western blotting 检测A549 细胞Survivin 蛋白的表达

Western blotting 图片经 Quantity One 软件扫描分析，比较各组Survivin 与GAPDH 蛋白光密度之比，与空白对照组比较，转染重组质粒组表达量均有不同程度的降低，这其中转染PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA‐2 质粒组表达量减少更为明显（P<0.01），见图7。说明PGP‐U6‐GFP‐neo‐shRNA‐2 对Survivin 基因的具有更好的干扰效果。

图7 不同重组质粒转染A549 细胞Survivin 蛋白的表达

3 讨论

Survivin 基因是凋亡抑制蛋白家族中分子量最小的成员，也是目前发现最强的凋亡抑制因子[3]。近年研究结果表明，Survivin 基因与肿瘤的发生、发展密切相关[4]，尤其在肺癌、胃腺癌、大肠癌、子宫内膜癌等肿瘤组织中高度特异性表达，其高表达与肿瘤的复发、浸润与转移密切相关[5‐8]。陈海伦等[9]指出Survivin 可能参与了宫颈癌的发生、发展过程，其表达水平有助于宫颈癌的预后评估。

RNA 干扰（RNAi）技术是目前研究哺乳动物基因功能的重要工具，它是指双链RNA 产生的小RNA 介导的特异性基因沉默现象，具有高度专一性，目前已广泛应用于生物医学等众多领域[10]。赵立强等[11]通过siRNA 干扰沉默Survivin 基因有效抑制了CNE‐2 细胞的增殖并诱导了细胞凋亡。秦静等[12]发现基因沉默Survivin 基因可以诱导视网膜母细胞瘤HXO‐RB44 细胞凋亡，同时下调血管形成相关因子血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶2（MMP‐2）、基质金属蛋白酶9（MMP‐9）的表达，进而抑制肿瘤新生血管形成。

本研究通过RNAi 技术，成功构建PGP‐U6‐GFP‐neo‐survivin‐shRNA 重组载体，通过转染A549 细胞株，检测细胞中Survivin mRNA 和蛋白的相对表达水平，结果显示，重组质粒组Survivin mRNA 和蛋白相对表达水平均明显低于空白对照组，为进一步研究Survivin基因在肿瘤治疗中的作用提供了载体工具。