3 种益生菌对抗生素相关性腹泻小鼠肠道乳酸杆菌数的影响

丘晓花，刘 霞，钟 平，陈 博，万 洁，蒋 杨（广东医科大学生理科学实验室，广东东莞 523000）

许多研究显示益生菌具有抗炎和调节肠道菌群的作用[1‐5]，通过口服活菌，增加肠道内活菌数量，以促进和维持肠道内微生态平衡，对肠道内病原菌直接或间接产生影响，从而排除致病菌和条件致病菌侵袭[6‐10]，而且益生菌具有良好的耐受性和极少的不良反应[11]，使其成为治疗抗生素相关性腹泻（ADD）的一种较佳的药物。虽然益生菌在ADD 治疗的临床应用中越来越常见，但并不是所有的益生菌对ADD 治疗都有效。本研究选取市场销售的3 种常见益生菌制剂对ADD小鼠进行治疗，采用实时荧光定量PCR 对治疗前后肠道内乳酸杆菌属的动态变化进行检测，研究这3 种益生菌制剂对乳酸杆菌属含量的改变，为临床选择益生菌制剂提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物与试剂

SPF 级昆明小鼠（广东医科大学实验动物中心提供）；乳酸杆菌标准菌种（广东医科大学病原生物实验室提供）；江中乳酸菌素片（国药准字H20059905）；丽珠双歧杆菌活菌胶囊（国药准字S10960040）；天桥牌干酵母片（国药准字H44022243）；细菌基因组 DNA快速抽提试剂盒、溶菌酶、SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒，购于生物工程（上海）股份有限公司；TB GreenRPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）购于宝生物大连（TaKaRa）生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 将SPF 级1 月龄、雌雄不限、体质量18～25 g 的58 只小鼠随机分为空白组14 只和试验组44 只。空白组小鼠每天灌胃等体积蒸馏水，试验组小鼠经抗生素灌胃，在第3 天后出现畏寒、胃纳差、毛色光泽、翻毛、黄色稀粪等腹泻症状。随机取出空白组4 只、试验组4 只小鼠，处死后取等量盲肠内容物，参照文献[10]进行细菌学检测。除肠杆菌外，试验组动物肠道中3 种优势菌明显减少，与空白组相比有显著差异。临床观察和菌群失调分析说明本次试验ADD造模成功。

1.2.2 试验分组、取样和DNA 提取 将制备成功的40只AAD 小鼠模型，随机分为模型组、乳酸菌素片组、双歧杆菌活菌组、酵母片组4 组，每组10 只。乳酸菌素片成人3.6～7.2 g/d，选定每人7.2 g/d 为实验用药剂量，按照标准动物的等效剂量折算系数法，换算成小鼠的等效剂量为每只0.018 g/d（标准体质量20 g），即0.9 g/kg，每日1 剂；双歧杆菌活菌胶囊成人0.7～1.4 g/d，选定1.4 g/（人·d）为实验用药剂量，按照标准动物的等效剂量折算系数法，换算成小鼠的等效剂量为每只0.0035 g/d（标准体质量20 g），即0.175 g/kg，每日1 剂；酵母片成人2.4～4.8 g/d，选定每人4.8 g/d 为实验用药剂量，按照标准动物的等效剂量折算系数法，换算成小鼠的等效剂量为每只0.012 g/d（标准体质量20 g），即0.6 g/kg，每日1 剂。空白组和模型组每天分别灌胃等体积蒸馏水，在用药8 d 后颈椎脱臼处死后采样，分别采集各组盲肠段粪便，充分暴露粪便于灭菌离心管内，加入适量灭菌PBS 于振荡器上混匀后，离心取上清后，收集细菌沉淀于离心管中。采用细菌总DNA 抽提试剂盒提取总DNA，于-20 ℃保存。

1.2.3 标准品的制备 按照细菌DNA 提取试剂盒提取乳酸杆菌的标准菌株的基因组DNA，以乳酸杆菌标准菌株基因组DNA 为模板进行常规PCR 扩增。根据NCBI 上公布的乳酸杆菌16S ribosomal RNA 序列（Gen Bank：MH810314.1）设计常规PCR 引物，序列S1:5'‐TGGAAGAACACCAGTGGCGAAGG‐3'，A1 5'‐TCACCAGAGTGCCCAACTAAATGC‐3'，扩增片段大小为447 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增体系为：模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，加ddH2O 至20 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，并按照胶回收试剂盒说明书回收切胶。回收PCR 产物用核酸测定仪测定其水平（OD260值），由公式（50×10‐6g/mL×OD260×N）/（660×产物碱基数）计算拷贝数Copies/mL（N 为阿伏加德罗常数）。

1.2.4 目的基因特异性引物的设计和合成 根据NCBI上公布的乳酸杆菌16S ribosomal RNA 序列（GenBank：MH810314.1）设计FQ‐PCR 特异性引物，上游引物：5'‐CTGTAACTGACGCTGAGATT‐3'，下游引物：5'‐TG AAGGGCGGAAACC‐3'，扩增片段大小为110 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.5 标准曲线的建立 用ddH2O 以10‐1～ 10‐8梯度倍比稀释已知拷贝数的标准品为模板，同时设置阴性对照，反应体系为：Taq2×PCR Master Mix 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.45 μL，模板2 μL，加ddH2O 至25 μL。反应程序为预变性：95 ℃ 30 s；扩增：95 ℃变性30 s；60 ℃延伸40 s；扩增40 个循环，在60 ℃采集荧光。以标准品的Cq 值为横坐标，拷贝数的对数为纵坐标，绘制标准品扩增曲线图。

1.2.6 样品FQ‐PCR 检测 分别取各样本所提取的基因组原液2 μL 作为模板进行FQ‐PCR 检测，每个样本重复测定3 次，获得Cq 值，3 次测定结果的平均值为最终测定结果，根据标准曲线计算出基因组拷贝数。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 标准品和目的基因扩增产物的鉴定

制备标准品的PCR 产物长度覆盖荧光定量PCR引物位置，PCR 产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，可见约450 bp 和110 bp 特异性条带，大小与预期一致，如图1。测序结果与NCBI 上公布的乳酸杆菌16S ribosomal RNA 序列（GenBank：MH810314.1）相比同源性为100%。

图1 标准品和目的基因PCR 产物电泳图

2.2 乳酸杆菌FQ‐PCR 标准曲线

乳酸杆菌标质量浓度为35.8 mg/L，拷贝数为7.31×1010copies/μL。重复管Cq值之差在0.5 以内，连续10 倍梯度质量浓度之间Cq值之差在17 左右。以模板质量浓度的对数为横坐标，Cq值为纵坐标，获得标准曲线方程：y=-3.4779x+38.483。其模板质量浓度的对数与Cq值之间呈较好的线性关系，相关系数为0.9843，斜率为-3.4779，扩增效率为93.87%。标准品扩增曲线、溶解曲线、标准曲线分别如图2、3、4。

图2 标准品扩增曲线

2.3 ADD 小鼠肠内乳酸杆菌属的定量检测结果

与空白组比较，模型组小鼠盲肠内乳酸杆菌群含量明显减少，经过2～8 d 的治疗，双歧杆菌活菌组、酵母片组与乳酸菌素片组的小鼠盲肠内乳酸杆菌群含量明显高于模型组（P<0.01），以乳酸菌素片组更为显著（P<0.01），见表1。

图3 标准品熔解曲线

图4 标准曲线

表1 盲肠内乳酸杆菌群基因组拷贝对数值 （，n=10）

表1 盲肠内乳酸杆菌群基因组拷贝对数值 （，n=10）

与空白组比较：aP<0.01；与模型组比较：bP<0.01；与双歧杆菌活菌胶囊比较：cP<0.01；与酵母片组比较：dP<0.01

3 讨论

益生菌是一类通过改善宿主菌群组成从而发挥有益作用的活性微生物[12]。益生菌可以改变消化道的局部pH 值，创造一个不利于病原体生长的局部环境；产生细菌素，发挥窄谱或广谱的病原体抑制作用；调节病原体衍生物的毒素，打断致病菌的群体效应；增强肠黏膜屏障功能；与病原体竞争营养物资以及粘附；还可以与上皮细胞和黏膜淋巴细胞进行交叉对话，发挥对天然免疫和特异性免疫的作用[13‐15]。

乳酸杆菌属是人或动物肠道中优势菌之一，它与人或动物关系密切。在人或动物的肠道菌群中，乳酸杆菌是有益于宿主健康的微生物，它通过产生乳酸、过氧化氢和细菌素等抗菌物质，或通过竞争肠道黏附位点或小肠食糜内的营养来抑制致病菌；通过诱导黏附素分泌细胞表面因子、蛋白质及可溶性肽，或者通过阻止细胞凋亡等途经来增强肠道的屏障功能，从而保护肠道[16‐20]。

本实验采用抗生素灌胃昆明小鼠制备ADD 模型，选取3 种益生菌进行干预治疗，应用荧光定量PCR 对空白组、模型组和3 种益生菌干预组盲肠内乳酸杆菌群的动态变化进行了定量检测，结果表明模型组盲肠内乳酸杆菌群含量与空白组比较显著下降（P<0.01），经过2～8 d 的治疗，双歧杆菌活菌组、酵母片组与乳酸菌素片组的小鼠盲肠内乳酸杆菌群含量明显高于模型组（P<0.01），以乳酸菌素片组更为显著（P<0.01），说明双歧杆菌活菌、酵母片及乳酸菌素片对抗生素相关性腹泻（ADD）肠道乳酸杆菌数具有调理作用，其中乳酸菌素片效果更好。