tst⁃1基因在儿童金黄色葡萄球菌肺炎感染中的临床应用价值

褚敏君 李新月 麻明彪 李珏 王海平 杜廷义★

金黄色葡萄球菌肺炎（staphylococcus aureuspneumonia，SAP）是目前儿童和婴幼儿期病死率较高的一种严重性疾病，早期识别儿童重症SAP 并及时采取干预措施，对提高救治成功率非常关键。中毒性休克综合征毒素（toxic shock syndrome toxin⁃1，TSST⁃1）是一种金黄色葡萄球菌特有的外毒素，由毒力基因tst⁃1编码合成。该毒素具有很强的超抗原活性，可引发机体炎症因子风暴，导致机体炎症失控和多器官损害。此外，TSST⁃1 还可直接损伤肝脏枯否细胞，使内毒素在体内大量蓄积，引发毒性休克综合征，加重感染程度。有研究提示tst⁃1基因的携带与金黄色葡萄球菌的致病性密切相关，该基因的存在可能反映患者的病情进展［1］。国内外研究发现，tst⁃1阳性菌株主要分离自呼吸道感染、菌血症和腹腔感染病例［2⁃4］，而检出科室主要集中在ICU，感染较重。本实验室近期完成的实验研究也发现tst⁃1基因在重症肺炎患儿中拥有极高的检出率，并且该基因的携带可进一步加重患儿病情［5］。由此产生了tst⁃1基因检测对于儿童SAP 重症化趋势是否具有预判价值的科学问题；并对此问题进行了初步的实验研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2018年11月至2020年12月昆明市儿童医院经临床诊断和病原学检测确诊为金黄色葡萄球菌性肺炎的196 例住院患儿。其中轻症肺炎142 例，重症肺炎54 例。轻重症肺炎患儿均以男性为主，年龄均主要分布在1月龄～1 岁，轻症肺炎患儿年龄中位数为2月，重症肺炎患儿年龄中位数为1月。轻重症肺炎组间性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。纳入标准：①28 天<患儿年龄≤14 岁，性别不限；②临床相关检查指标（包括血常规、CRP、PCT 或影像学检查）和病原学检测支持确诊为SAP 患儿；③患儿临床资料完整。排除标准：①肺部手术史、肺栓塞、肺水肿、肺结核等肺部疾病；②免疫抑制、粒细胞减少症以及肝肾功能严重异常；③发育不良或严重营养不良；④恶性肿瘤、多发性感染；⑤中途转院或资料缺失。本研究经院伦理委员会批准，受试患儿家属均签署知情同意书。

表1 肺炎患儿一般情况比较Table 1 Comparison of general conditions of children with pneumonia

1.2 肺炎严重程度分组

通过医院His 系统查阅肺炎患儿整个住院过程中的临床数据，观察患儿住院期间的进展情况，根据中华人民共和国国家卫生健康委员会2019年制定的标准［6］对肺炎患儿进行评估，分为轻症肺炎组和重症肺炎组。

1.3 样本含量估算

采用病例对照研究样本含量相关公式进行估算：根据前期研究［5］，tst⁃1基因在重症SAP 中检出率为72%，代入病例组估计暴露率，预估tst⁃1基因在轻症SAP 中检出率为20%，代入对照组估计暴露率，检验水准α 取0.05，检验效能1⁃β 取0.8，计算得重症SAP 组和轻症SAP 组至少各需样本量20 例，本次研究总样本量应大于等于40 例。

1.4 实验菌株

收集纳入研究患儿的深部痰液、肺泡灌洗液分离培养得到的SA 菌株。纳入标准：①采集标本需合格（判断标准：鳞状上皮细胞<10/LP，白细胞>25/LP 或鳞状上皮细胞：白细胞<1∶2.5）。②所有菌株经菌落形态观察、革兰染色镜检以及VITEK⁃2 Compact 全自动微生物分析仪进行鉴定。③剔除同一病例的重复菌株。

1.5 主要仪器及试剂

VITEK⁃2 Compac 全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司），ABI 7300 荧光定量PCR 仪（美国赛默飞世尔科技公司），细菌基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），TB Green™Premix Ex Taq™II 试剂盒（大连宝生物工程有限公司），PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.6 实验方法

1.6.1 细菌DNA 模板制备

使用TaKaRa 公司提供的细菌基因组DNA 提取试剂盒并严格按照说明书进行提取。

1.6.2tst⁃1基因引物

tst⁃1基因引物序列见表2。

表2 tst⁃1 基因引物序列Table 2 Primer sequence of tst⁃1 gene

1.6.3 实时荧光定量PCR 反应体系及反应条件

使用实时荧光定量PCR 检测tst⁃1基因，反应体系总体积为20 μL，其中SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，10 μΜ Forward/Reverse Primer 各0.8 μL，细菌DNA 模板2 μL，ROX 染料0.4 μL，RNase⁃free water 6 μL。反应体系配制及加样操作均在冰上进行。PCR 扩增反应条件：94℃5 min，30×（94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min），72℃10 min，阳性样本在扩增反应图谱中呈现S 型曲线。

1.6.4 质量控制

在检测过程中加入阳性对照（ATCC43300）和阴性对照（ATCC29213）。扩增结束后增加熔解曲线测定以验证引物特异性，排除非特异性扩增。

1.7 统计学方法

采用SPSS 25 软件进行数据统计分析；计数资料以n（%）表示，行χ2检验；年龄为非正态分布计量资料，以中位数和四分位数间距表示，比较采用非参数U 检验；绘制ROC 曲线分析tst⁃1基因对儿童重症SAP 的诊断价值。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 tst⁃1 基因检测结果在肺炎患儿中的分布

在196 株金黄色葡萄球菌中，共检出tst⁃1基因阳性菌株24 株，检出率为12.24%。其中，轻症肺炎中共检出7 株（7/142），检出率为4.93%，重症肺炎中共检出17 株（17/54），检出率为31.48%。重症肺炎中tst⁃1基因的检出率高于轻症肺炎，差异有统计学意义（χ2=25.668，P<0.05）。见表3。

表3 tst⁃1 基因在肺炎患儿中的分布［n（%）］Table 3 the distribution of tst⁃1 gene in children with pneumonia［n（%）］

2.2 tst⁃1 基因对儿童重症SAP 的诊断试验评价

tst⁃1基因对儿童重症SAP 诊断的灵敏度为0.315（95%CI：0.199～0.457），特异度为0.951（95%CI：0.897～0.978），阳性预测值为0.708（95%CI：0.488～0.866），阴性预测值为0.785（95%CI：0.714～0.842），曲线下面积为0.633。见图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

3 讨论

肺炎是儿童时期的常见病和多发病，SAP 是儿童感染常见的细菌性肺炎之一。在本研究中，SAP 感染主要分布在1月龄～1 岁，其占比超过了70%，提示SAP 主要以婴幼儿为主，具有幼龄化的特征，与文献报道一致［7⁃8］。由于患儿年龄小且金黄色葡萄球菌致病力强，感染后病情进展迅速，如不及时治疗，极易引起脓毒血症、毒性休克综合征等一系列严重并发症，病死率较高。因此，早期识别儿童重症SAP，对提高救治成功率非常关键。

目前重症肺炎的识别主要从反映呼吸系统或全身炎症反应严重程度的临床表现来判断［9］，某些生化指标虽被认为与肺炎的严重程度或预后有一定的相关性［10］，但都不能明确诊断或判断重症肺炎的预后，且无论是临床表现还是生化指标，均在患儿病情加重时才会发生较大幅度变化，对于SAP 这样病情进展迅速的疾病来说已经相对较晚，主要作为病情监测指标而非早期鉴别指标。因此，对儿童重症SAP 的诊治迫切需要新的、可靠的在早期诊断方法和指标。

感染性疾病严重程度主要取决于病原菌毒力与宿主免疫反应之间的关系［11］，研究毒力基因在疾病中的分布及作用可为SAP 感染严重程度的诊断提供新的思路。金黄色葡萄球菌毒力基因tst⁃1主要通过编码合成中毒性休克综合征毒素（TSST⁃1）致病。该毒素是一种金黄色葡萄球菌特有的外毒素，具有很强的超抗原活性。当金黄色葡萄球菌入侵机体时，TSST⁃1 通过发挥超抗原作用，引发机体炎症因子风暴，导致机体炎症失控和多器官损害。此外，TSST⁃1 还可直接损伤肝脏枯否细胞，抑制内毒素脱颗粒反应并使其在体内大量蓄积，引发毒性休克综合征，加重感染程度。

在临床研究方面，Koosha 等［1］研究发现，携带tst⁃1基因的金黄色葡萄球菌越多，疾病的易感性越强。段晓丹等［12］报道tst⁃1基因阳性临床分离株主要来源于痰液、脓液标本，提示tst⁃1阳性菌株很可能引发呼吸系统及化脓方面感染。麻明彪等［5］对常见毒力基因在儿童SA 肺炎及化脓性感染中的分布与疾病临床表现之间的关系进行研究，发现tst⁃1基因在重症肺炎组中有极高检出率，并且该基因的携带可加重患儿临床病情。在本研究中，tst⁃1基因在呼吸道标本中的总检出率为12.24%，与国内外近年来报道的10%～30%大致相符［13⁃14］，其中，重症肺炎中tst⁃1基因的检出率高于轻症肺炎（P<0.05）。通过关联强度分析得到OR 值为8.927，即tst⁃1+SA 感染儿童患重症SAP 的危险性是tst⁃1⁃SA 感染儿童患重症SAP 危险性的8.927 倍，且95%CI下限大于1，提示tst⁃1基因阳性与重症SAP 呈正相关关系，携带有tst⁃1基因的菌株是导致儿童重症SAP 肺炎发生的危险因素，该基因的检测对临床儿童重症SAP 的诊断和病情预判具有潜在价值。

进一步的诊断效能评价显示，tst⁃1基因对重症SAP 的诊断有较高特异度（0.951），但灵敏度（0.315）相对较低，并且受灵敏度较低的影响，ROC曲线下面积仅为0.633。如果要对重症SAP 进行早期预判和筛检，及时进行干预，所选取的指标需要较高的灵敏度，因此tst⁃1基因作为重症SAP 的早期筛检指标还存在不足。

作为一种感染性疾病，肺炎的发生及病情进展受人群、菌株、社区或医院环境等多种因素共同影响［15］，使用单一因素对其进行直接预判是不够全面的。有文献报道称，年龄、早产、先天性心脏病、伴随贫血、多重耐药菌感染、生活环境差以及季节均是重症肺炎发病危险因素［16］，因此需要对多种因素进行联合分析诊断以提高敏感度及特异度。在这一过程中，tst⁃1基因作为一个有价值的危险因素，虽然单独的诊断价值有限，但可参与到重症SAP 的多因素分析及风险评估模型的建立之中。

此外，本次研究是从临床层面研究并发现tst1基因与重症SAP 具有一定的相关性，在未来可开展细胞、动物实验，减少干扰因素，进一步验证tst⁃1+SA 与肺炎重症化的关系。

综上所述，tst⁃1+SA 是导致重症SAP 发生的重要危险因素，对于重症SAP 的预测具有潜在的应用价值，但存在不足。对其在临床鉴别诊断，病情预判方面的应用研究，应结合其它危险因素进行深入广泛的研究和探讨。