引起食用菌蛛网病的Cladobotryum 属3 种病原真菌的生物学特性研究*

兰玉菲，唐丽娜，李秀梅，李晓颖，孔 怡**

（1.泰安市农业科学院，山东 泰安 271000；2.山东芝人堂药业有限公司，山东 泰安 271000）

蛛网病是由菌寄生属（Hypomyces） 真菌侵染引起的食用菌病害，该病可侵害多种食用菌，在欧洲、美洲和亚洲等地均已有报道[1-7]。近几年通过对食用菌病虫害发生情况调研发现，食用菌蛛网病在山东地区零星发生，但一旦发生会迅速蔓延，同时产生大量孢子，给菇农造成严重的损失。最初，于2014年在邹城双孢蘑菇（Agaricus bisponus） 工厂化厂房内发现类似蛛网病的病害，经柯赫氏法则验证及形态学和分子生物学鉴定，其致病病原菌无性型为Cladobotryum mycophilum、 有 性 型 为 Hypomyces odoratus，这也是首次在中国发现由该病原菌引起的双孢蘑菇蛛网病[8]。2017 年，在济宁市金乡县金针菇（Flammulina velutipes） 菇棚内发现金针菇蛛网病，通过分子鉴定并结合形态特征，鉴定病原菌为金黄菌寄生菌，其有性型为Hypomyces aurantius(Pers.) Fuckel、无性型为Cladobotryum varium Nees[9]。2019 年，在泰安市农业科学院羊肚菌（Morchella spp）. 大棚中发现类似蛛网病的病害，通过分子鉴定并结合形态特征，鉴定其病原菌为Cladobotryum protrusum，首次向世界报道由C. protrusum 引起的羊肚菌蛛网病[10]。

基于前期对双孢蘑菇蛛网病病原菌C. mycophilum 的生物学特性进行初步研究[11]，此次试验拟对引起食用菌蛛网病的Cladobotryum 属3 种病原真菌（C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum） 的生物学特性进行比较和分析，以期为食用菌蛛网病的科学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株为前期研究中从山东省双孢蘑菇、金针菇和羊肚菌上分离、鉴定并保存的蛛网病病原菌C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum。

1.2 基础培养基

基础培养基配方：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、琼脂粉20 g，水定容至1 L。

1.3 病原菌在PDA 培养基上的培养特性和形态特征

将保存的病原菌分别接种到PDA 培养基上，于25 ℃恒温黑暗培养。采用划“十”字交叉法测量菌落直径，计算菌丝日生长速度，观察并记录初生菌丝颜色、菌落颜色变化、表面特征、色素产生情况等。利用BX41 显微成像系统[奥林巴斯（中国） 有限公司] 观察孢子形态和大小等，并拍照记录。

1.4 温度对菌丝生长的影响

将病原菌菌株在PDA 培养基上培养3 d～6 d，用打孔器取5 mm2菌落接种到PDA 平板上，分别置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃下黑暗培养，每个处理5 次重复。采用划“十”字交叉法测量菌落直径，计算菌丝日生长速度并进行方差分析。具体方法参照参考文献[11]。

1.5 碳源筛选

按照基础培养基的配方，分别用蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖替代葡萄糖。制成平板培养基后分别接入菌丝块，于25 ℃恒温、黑暗培养，每个处理5 个重复。数据测量和分析方法同1.4。

1.6 氮源筛选

按照基础培养基的配方，分别用牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵代替蛋白胨。数据测量和试验方法同1.5。

1.7 病原菌菌丝致死温度的测定

参照参考文献[11]的方法，取培养好的新鲜菌丝分装于离心管中，水浴10 min，水浴温度分别设为35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃。无菌条件下将水浴处理的菌丝块移至PDA 平板培养基上，25 ℃黑暗培养，每个处理5 个重复。根据试验结果进一步按1 ℃梯度设计温度梯度，进行相同处理，确定菌丝的致死温度。

2 结果与分析

2.1 3 种病原真菌在PDA 培养基上的生长特性

将3 种病原真菌分别接种到PDA 平板上，25 ℃黑暗培养，观察其培养特性。Cladobotryum 属3 种病原真菌在培养过程中的菌落生长情况及颜色变化见图1。

由图1 可知，C. mycophilum 培养15 d 产生红色色素，C. varium 培养至35 d 也未产生色素，C. protrusum 培养7 d 即开始产生红色色素。如组图A 所示，PDA 培养基上C. mycophilum 菌落初期为白色，气生菌丝发达，而后逐渐变为淡黄色或粉红色，后期整个培养基变成红色；培养5 d～6 d 即可长满整个平板。如组图B 所示，PDA 培养基上C. varium 生长初期菌丝洁白浓密，菌落边缘整齐，后期有粉状分生孢子产生；该菌株不产生色素。如组图C 所示，C. protrusum 在PDA 培养基上培养3 d～4 d 即可长满直径为90 mm 的培养皿；菌落初期为白色，而后逐渐变为黄色，后期呈砖红色。

图1 3 种病原真菌的生长及色素产生情况Fig. 1 Growth and pigment production of three kinds of pathogenic fungi

Cladobotryum 属3 种病原真菌的微观观察形态特征记录结果见表1。

表1 3 种病原真菌的微观形态特征Tab.1 Micromorphological characteristics of three kinds of pathogenic fungi

如表1 所示，Cladobotryum 属3 种病原真菌的分生孢子形态和大小存在差异。C. mycophilum 的产孢细胞大小为（25～40） μm ×（4～6） μm，顶端略尖（2 μm～4 μm）；分生孢子呈椭圆形或卵圆形，有时稍弯曲，大小为（16～24） μm×（6～8） μm，具有1～3 个分隔。C. varium 菌丝为有隔菌丝，在菌丝上形成分生孢子梗，分生孢子梗分枝并轮生，在小梗顶端形成分生孢子，分生孢子呈椭圆形，单细胞或双细胞，大小为（12.4～16.8） μm ×（6.4～8.6） μm，无色透明。C. protrusum 的产孢细胞为多细胞，顶端有突起；分生孢子椭圆形，大小为（20.8～25.6） μm×（5.6～7.8） μm，透明至淡绿色，具有0～1 个分隔。

2.2 温度对3 种病原真菌菌丝生长的影响

温度对Cladobotryum 属3 种病原真菌的菌丝生长影响结果见表2。

表2 不同温度对3 种病原真菌菌丝生长的影响Tab.2 Effect of temperature on the mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表2 可知，C. mycophilum 在15 ℃～30 ℃均能生长；25 ℃时菌丝生长速度最快，其次是20 ℃，35 ℃菌丝停止生长。C. varium 在20 ℃和25 ℃时菌丝生长最快，其次是15 ℃，30 ℃时菌丝停止生长。C. protrusum 在15 ℃～35 ℃均能生长；在25 ℃时菌丝生长速度最快，其次是20 ℃和30 ℃，35 ℃时菌丝停止生长。因此，C. mycophilum 和C. protrusum生长最适温度为25 ℃，C. varium 生长最适温度为20 ℃～25 ℃。

2.3 不同碳源对3 种病原真菌菌丝生长的影响

不同碳源对Cladobotryum 属3 种病原真菌的菌丝生长影响结果见表3。

表3 碳源对3 种病原真菌菌丝生长的影响Tab.3 Effect of carbon source on the mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表3 可知，Cladobotryum 属3 种病原真菌在供试的5 种碳源培养基上均能生长。C. mycophilum菌丝在以乳糖、蔗糖和果糖为碳源的培养基上生长较快，且差异不显著，其次是葡萄糖和麦芽糖；但在以乳糖为碳源的培养基上较稀疏，以其他4种碳源培养基上菌丝浓密，长势好；因此C. mycophilum 最适碳源为蔗糖。C. varium 菌丝在以麦芽糖为碳源的培养基上生长最快，长势好，且与其他4 种碳源条件下的菌丝生长速度差异显著；因此C. varium 最适碳源为麦芽糖。C. protrusum 菌丝在以乳糖为碳源的培养基上生长最快，但长势稀疏；其次是果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，且4种碳源差异不显著；但在以葡萄糖为碳源的培养基上生长较稀疏；因此C. protrusum 最适碳源为果糖、蔗糖和麦芽糖。

2.4 不同氮源对3 种病原真菌菌丝生长的影响

不同氮源对Cladobotryum 属3 种病原真菌的菌丝生长影响结果见表4。

表4 氮源对3 种病原真菌菌丝生长的影响Tab.4 Effect of nitrogen source on mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表4 可知，Cladobotryum 属3 种病原真菌在供试的5 种氮源培养基上均能生长。C. mycophilum菌丝在以蛋白胨和牛肉膏为氮源的培养基上生长最快，二者差异不显著，且长势好；其次是酵母膏；在以硫酸铵和硝酸铵为氮源的培养基上生长最慢；因此C. mycophilum 最适氮源为蛋白胨和牛肉膏。C. varium 菌丝在以酵母膏为氮源的培养基上生长最快，且长势好；其次是牛肉膏、硝酸铵和蛋白胨；在以硫酸铵为氮源的培养基上生长最慢；因此C.varium 最适氮源为酵母膏。C. protrusum 菌丝在以酵母膏为氮源的培养基上生长最快，且长势好；其次是牛肉膏和蛋白胨；在以硝酸铵为氮源的培养基上生长最慢，因此C. protrusum 最适氮源为酵母膏。

2.5 3 种病原真菌菌丝致死温度

C. varium 和C. protrusum 的菌丝在35 ℃～45 ℃水浴处理10 min 后仍可在PDA 培养基上继续生长，当温度高于50 ℃后均不能生长，进而在45 ℃～50 ℃范围内按1 ℃梯度设计6 个温度梯度进行处理。试验发现C. varium 菌丝在46 ℃～50 ℃水浴处理后均不能再生长，由此确定其菌丝的致死温度为46 ℃；C.protrusum 菌丝在48 ℃、49 ℃和50 ℃水浴处理后不能生长，由此确定其菌丝的致死温度为48 ℃。前期研究中利用同样方法确定了C. mycophilum 菌丝的致死温度为49 ℃[11]。综合分析表明3 种病原真菌的菌丝致死温度存在差异，相比较C. mycophilum 和C.protrusum 更耐高温。

3 小结

通过对引起食用菌蛛网病的Cladobotryum 属3种病原真菌（C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum） 的生物学特性进行比较和分析，发现3 种病原真菌在PDA 培养基上的培养特性和形态特征存在差异。C. protrusum 菌丝生长最快；C. mycophilum 和C. protrusum 培养后期均产生红色色素，C. varium 培养至35 d 仍未观察到有色素产生；C. mycophilum 和C. protrusum 生长最适温度为25 ℃，C. varium 生长最适温度范围为20 ℃～25 ℃；C. mycophilum 菌丝致死温度为49 ℃，C. varium 菌丝的致死温度为46 ℃，C. protrusum 菌丝的致死温度为48 ℃。此外，研究结果表明C. mycophilum 的最适碳源为蔗糖，最适氮源为蛋白胨和牛肉膏；C. varium 最适碳源为麦芽糖，最适氮源为酵母膏；C. protrusum 适宜生长的碳源为果糖、蔗糖和麦芽糖，最适氮源为酵母膏。研究结果能够为深入研究蛛网病在食用菌中的发生规律、流行动态及综合防治提供理论参考。