丁酸钠联合电离辐射对肺癌A549细胞凋亡的影响及其机制

郎庆旭,牛雪霜,杨凯文,张 韧,王思腾,祖米热提古丽·吾买尔,王珍琦

（1.吉林大学公共卫生学院 国家卫健委放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021；2.北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013）

肺癌是最常见的恶性肿瘤，也是引起癌症患者死亡的主要原因［1-2］。约70%的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者确诊时为晚期［1，3］，多数患者确诊时难以切除，其治疗主要依靠化疗与放疗相结合。放射治疗是临床癌症的主要治疗方法之一，但肿瘤的放射抵抗和放射治疗的不良反应限制了其治疗效果和应用。联合应用放射增敏剂可提高放射治疗的疗效。丁酸钠（sodium butyrate，NaBt）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor， HDACi），已被证明在多种癌症中抑制肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡，延缓肿瘤细胞的侵袭和转移，包括肝癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结直肠癌、慢性髓细胞白血病和肺癌等，但其在很多癌症中的确切作用尚未阐明［4-10］。 本 课 题 组 前 期 研 究［11］揭 示 了 NaBt对NSCLC A549细胞具有增殖抑制作用，并呈浓度和时间依赖性，且NaBt和X射线联合应用抑制效果明显优于二者单独应用，其机制可能与二者联合引起A549细胞G2/M期阻滞有关。为了进一步揭示NaBt和X射线的联合对肺癌A549细胞的作用及其潜在机制，本研究探讨了二者单独或联合应用时对细胞 凋 亡、 线 粒 体 膜 电 位 （mitochondrial membrane potential， Δψm）、 活 性 氧 （reative oxygen species，ROS）水平和相关基因表达水平的影响，以期为NSCLC的放射治疗提供新的策略和实验室依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 人A549细胞购自中国科学院上海细胞库，采用高糖DMEM常规培养。NaBt（美国Sigma公司），胎牛血清（浙江杭州四季青生物制品分公司），高糖DMEM（美国GIBCO公司），胰蛋白酶（上海生物技术有限公司），Annexin-Ⅴ/FITC凋亡检测试剂盒（美国BD公司），罗丹明123试剂盒（北京索莱宝生物科技公司），ROS试剂盒（中国碧云天生物技术有限公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测试剂盒（中国Novoprotein公司），其他试剂为国产分析纯。X射线深部辐照仪（X-RAD 320 ix，德国PXI公司），Epoch酶标仪（美国BioTek公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），RT-qPCR仪（美国Bio-Tek公司）。

1.2 实验分组和照射处理 人A549细胞分为对照组、NaBt组、4 Gy X射线照射组和NaBt联合4 Gy X射线照射组。采用X射线深部辐照仪照射，电压180 kV，电流20 mA，单次源靶距70 cm，剂量率 1.0 Gy·min－1，照 射时间 4 min，照射 剂量4 Gy。

1.3 流式细胞术检测各组细胞凋亡率、Δψm和ROS水平 将对数生长期A549细胞接种于6孔细胞培养板中，24 h 后加入 NaBt（10 mmol·L－1），作用24 h后给予4 Gy X射线照射，24和48 h后用0.25% 胰酶消化后，1 000 r·min－1离心 5 min，弃上清，加入1 mL预冷的PBS缓冲液洗涤2次。Annexin Ⅴ/PI双染色，加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL，室温避光孵育 10 min，加入 PI（20 mg·L－1）10 μL，室温避光孵育5 min，尼龙网过滤后上机检测各组细胞凋亡率，细胞凋亡率以百分率表示。照射后6 h按照上述方法收集细胞，加入500 μL稀释后的罗丹明123，在37℃恒温培养箱中孵育40 min，重悬细胞用300目尼龙布过滤细胞至流式管，立即上机检测Δψm，以平均荧光强度（meanfluorescence intesnsity，MFI）表示。照射后6 h，加入适当体积的2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸 酯 （2′， 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），37℃细胞培养箱内孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，0.25%胰酶消化细胞，加入完全培养基终止消化，制成细胞悬液，1 500 r·min－1离心5 min，用PBS缓冲液洗涤1～2次，过滤后上机检测ROS水平，以MFI表示。采用CellQuest软件收集细胞，ModFit软件分析结果，至少收集1×104个细胞。

1.4 RT-qPCR法检测各组细胞中caspase-3和p21 mRNA表达水平 将经NaBt处理和4 Gy X射线照射的A549细胞继续培养24 h之后，采用TRIzol法提取各组细胞总RNA，按照美国Invitrogen公司的TRIzol操作说明书步骤进行。用Epoch酶标仪测定总RNA浓度和纯度，－80℃冰箱保存备用。制备cDNA，RT-qPCR法检测各组细胞中caspase-3和p21 mRNA表达水平，以GAPDH基因为内参。caspase-3， 正 向 引 物 5′-AAGGCAGAGCCATGGACCAC-3′， 反 向 引 物 5′-CTGGCAGCATCATCCACACATA-3′；p21，正向引物 5′-AGGCCAAAGCCTATGGTGGAC-3′， 反 向 引 物 5′-TCTAGCAGGCCGTTGATGGAG-3′；GAPDH，正向引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′， 反 向 引 物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。 实 时 定 量PCR反应条件：95℃、1 min，95℃、20 s，60℃、20 s，72℃、30 s，共40个循环。采用相对标准曲线进行结果分析，利用Ct值和相对标准曲线可以得到初始模板量，以目的基因与GAPDH基因初始模板之比表示目的基因mRNA表达水平。

1.5 统计学分析 采用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析。各组细胞凋亡率、Δψm、ROS水平和caspase-3及p21 mRNA表达水平均以±s表示，经正态性检验均符合正态分布，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率 NaBt单独或联合4 Gy X射线作用A549细胞24和48 h，与对照组、NaBt组和4 Gy X射线照射组比较，NaBt联合4 Gy X射线照射组细胞凋亡率均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。作用48 h，与对照组比较，NaBt组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）。见图1和表1。

表1 各组细胞凋亡率Tab.1 Apoptotic rates of cells in various groups (n=3,±s,η/%）

表1 各组细胞凋亡率Tab.1 Apoptotic rates of cells in various groups (n=3,±s,η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NaBt group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Apoptotic rate Control NaBt 4 Gy X-ray irradiation NaBt combined with 4 Gy X-ray irradiation 48 14.33±1.57 79.08±2.56**20.71±7.21 89.29±0.36**△＃＃（t/h） 24 11.51±4.59 25.92±1.92 10.99±4.33 43.60±5.86*△△＃

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of A549 cells in various groups detected by flow cytometry

2.2 各组细胞Δψm和ROS水平 NaBt单独或联合4 Gy X射线作用A549细胞6 h后，分别与对照组、NaBt组和4 Gy X射线照射组比较，NaBt联合4 Gy X射线照射组细胞Δψm均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；与对照组比较，NaBt组和NaBt联合4 Gy X射线照射组细胞ROS水平均升高（P＜0.05）；与4 Gy X射线照射组比较，NaBt联合4 Gy X射线照射组细胞ROS水平升高（P＜0.05）；与NaBt组比较，NaBt联合4 Gy X射线照射组细胞ROS水平有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2和表2。

表2 各组细胞Δψm和ROS水平Tab.2 Levels of Δψm and ROS in cells in various groups(n=3,±s，MFI）

表2 各组细胞Δψm和ROS水平Tab.2 Levels of Δψm and ROS in cells in various groups(n=3,±s，MFI）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.01 vs NaBt group；＃P＜0.05 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Control NaBt 4 Gy X-ray irradiation NaBt combined with 4 Gy X-ray irradiation Δψm 14.15±3.85 6.79±0.51 6.94±1.38 2.81±0.79*△＃ROS 2.23±0.90 13.87±4.64*2.65±0.57 16.84±3.06*＃

图2 流式细胞术检测各组细胞Δψm和ROS水平Fig.2 Levels of Δψm and ROS in cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 各组细胞中caspase-3和p21 mRNA表达水平 NaBt单独或联合4 Gy X射线作用A549细胞24 h后，与对照组、NaBt组和4 Gy X射线照射组比较，NaBt联合4 Gy X射线照射组细胞中caspase-3和p21 mRNA表达水平均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；与对照组比较，NaBt组和4 Gy X射线照射组细胞中p21 mRNA表达水平均明显升高（P＜0.01）；与4 Gy X射线照射组比较，NaBt组细胞中p21 mRNA表 达 水 平 明 显 升 高 （P＜0.01）。见表3。

表3 各组细胞中caspase--3和p21mRNA表达水平Tab.3 Expression levels of caspase -3 and pp2211 mRNA of cells in various groups (n=3，±s）

表3 各组细胞中caspase--3和p21mRNA表达水平Tab.3 Expression levels of caspase -3 and pp2211 mRNA of cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NaBt group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Control NaBt 4 Gy X-ray irradiation NaBt combined with 4 Gy X-ray irradiation P21 1.00±0.16 6.85±0.30*＃＃3.68±0.19*16.09±1.67*△△＃＃Caspase-3 1.00±0.18 1.32±0.10 0.92±0.19 2.75±0.53*△＃

3 讨 论

越 来 越 多 的 证 据［5-7，12-14］表 明 ： HDACi中 的NaBt具有抗肿瘤活性，且HDACi介导的肿瘤细胞死亡通常是诱导细胞凋亡。而凋亡途径的缺陷和凋亡蛋白的失调，在癌症的发生和治疗耐药中起着决定性的作用［15-16］。

本课题组前期研究［11］显示：NaBt对NSCLC A549细胞具有增殖抑制作用，并呈浓度和时间依赖性，可引起细胞G1/G0期阻滞。为进一步探索其肿瘤抑制机制，本研究检测了NaBt作用后A549细胞凋亡率、ROS水平、Δψm和 caspase-3及 p21 mRNA表达水平，结果显示：NaBt可诱导肺癌A549细胞凋亡，且呈时间依赖性，表明NaBt在A549细胞中的细胞毒作用是通过细胞凋亡引起的。NATONI等［17］在胰腺癌细胞中也发现：NaBt通过内源性和外源性凋亡途径致敏。同时，在本研究中，NaBt引起A549细胞ROS水平升高。ROS积累会导致某些细胞功能受损并有促进细胞凋亡作用［18］。以往有研究［19］证实：NaBt通过氧化应激诱导细胞凋亡，与本研究结果一致。本研究结果显示：NaBt作用后，A549细胞Δψm下降，与ROS水平升高相一致，提示ROS和线粒体膜参与该过程。线粒体是ROS攻击的靶点之一，ROS可导致Δψm下降［20］。同时，本研究结果显示：NaBt作用后，A549细胞中caspase-3和p21 mRNA表达水平升高。caspases活性信号分子的功能与细胞凋亡和炎症相关，其中，caspases-3是凋亡的执行者［21］。本研究中caspase-3 mRNA表达水平升高与凋亡率升高结果相一致。以上结果提示：NaBt通过ROS水平升高和线粒体损伤进而导致A549细胞凋亡。p21 mRNA表达水平升高提示NaBt对细胞周期的影响。CHEN等［22］发现：NaBt与多西紫杉醇丙酸钠联合对A549细胞有增殖抑制和促进凋亡作用。所以NaBt可能是一种有效的NSCLC临床治疗药物。

本研究同时检测了4 Gy X射线照射对A549细胞的作用，结果显示：各组细胞上述各检测指标均无明显变化，可能是由于A549细胞的辐射抗性。而NaBt和4 Gy X射线联合作用，则引起A549细胞凋亡，且呈时间依赖性，细胞中ROS水平升高，Δψm降低，caspase-3和p21 mRNA表达水平升高，且二者联合作用效果更优，表明NaBt通过增加辐射诱导的A549细胞线粒体损伤而引起细胞凋亡增加，与本课题组之前的研究［11］结果相一致。有研究［23］显示：HDACi CUDC-101和SAHA在胰腺癌细胞中可增强辐射引起的细胞毒作用。HDACi能够增加甲状腺癌的辐射敏感性［24］。

综上所述，NaBt可能是一种有效的NSCLC临床治疗药物，同时可能有助于提高辐射敏感性。本研究为NSCLC的治疗提供了新的策略，对NSCLC患者的治疗具有重要的临床意义。