高效液相色谱法测定替诺福韦工艺废水中DESMP含量*

于 洋，刘治中，王建刚

（吉林化工学院 资源与环境工程学院，吉林 吉林 132022）

替诺福韦（PMPA）及其前药替诺福韦酯属于开环膦酸核苷类抗病毒药物，具有非常好的抗DNA病毒和逆转录病毒感染的作用[1]，被广泛用作临床治疗艾滋病毒（HIV），乙肝病毒（HBV），疱疹病毒（HSV）等感染的药物[2]。对甲苯磺酰氧甲基膦酸二乙酯（DESMP）是合成替诺福韦的关键中间体[3]，同时也是杀菌剂、除草剂及汽车装饰材料高光黑膜的重要生产原料[4]。

DESMP工业化生产多采用两步法，首先，以亚磷酸二乙酯和甲醛或多聚甲醛在一定温度下反应制备羟甲基膦酸二乙酯，再以羟甲基膦酸二乙酯和对甲苯磺酰氯为原料，碱为缚酸剂催化反应，经萃取、水洗、蒸馏回收溶剂制备而成[5-8]。在萃取、水洗过程中，会产生一定量的碱性废水，这给后期环保处理带来巨大压力。对工业废水处理，通常以测定废水中CODCr值来反映有机物污染物含量，这并不能有效反映废水中实际有机物的种类及含量，无法做到针对性处理。因此，有必要建立水洗过程废水中DESMP的分析方法，为开发合理的废水处理工艺提供参考依据。

已有关于DESMP的报道多集中于合成工艺的探讨[9-11]，亦有关于替诺福韦的液相色谱分析方法研究[12,13]，但不适合碱性废水中DESMP含量的测定。本研究采用高效液相色谱法测定反应工艺水洗废水中DESMP的含量，为进一步控制废水排放，寻求合理的废水减量化、资源化处理方法提供必要的检测手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-100型液相色谱仪、紫外检测器、LC-100型数据处理系统，上海伍丰科学仪器有限公司；AUX120型分析天平（日本岛津公司）；AS5150A型超声波振荡器（天津奥特塞斯仪器有限公司）；Molresearch超纯水仪（重庆摩尔水处理设备有限公司）。

标准储备液 天平精密称取DESMP标准品0.1552g，用50mL甲醇溶解，流动相转移至500mL的容量瓶中，超声振荡脱气5min，流动相稀释至刻度，混匀，配制DESMP浓度为310.40mg·L-1标准储备液，4℃冰箱保存。

DESMP碱性水洗废水2021年5月采集于某化工厂，聚四氟乙烯塑料采样瓶密封，4℃冰箱保存。

H3PO4（AR南京化学试剂股份有限公司）；甲醇（HPLC天津永大化学试剂有限公司）；DESMP（AR贝斯特试剂成都点纯科技有限公司）；试验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

液相色谱柱：VP-ODS（150mm×4.6mm，5μm）；柱温：30℃；定量环进样20μL；流动相为含0.1%（V/V）H3PO4水溶液（流动相A）和甲醇（流动相B）的混合液，流动相A∶流动相B=50∶50，等度洗脱；色谱柱流量：1.0mL·min-1；LC-100紫外-可见检测器，检测波长230nm。以色谱峰保留时间定性，采用外标法峰面积定量。

1.3 试验方法

将待测试样品摇匀，准确吸取0.50mL试验样品于100mL容量瓶中，用50%流动相A与50%流动相B的混合液溶解，超声波振荡器脱气5min，稀释至刻度线，混匀。色谱进样前，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液按仪器工作条件分析。

2 结果与讨论

2.1 流动相选择

DESMP分子结构中有亲水官能团磺酰氧甲基膦酸二乙酯基和疏水官能团对甲基苯基。对甲基苯是弱极性疏水性基团，与非极性色谱填料C18有强相互作用，流动相极性减小可使其保留时间减小。对于甲醇-水组成的二元流动相体系，随着水含量的增加，流动相极性增加，DESMP与C18固定相的相互作用增强，保留时间延长。

对比不同H3PO4（0.1%）水溶液（流动相A）/甲醇（流动相B）混合液作流动相时，等度洗脱DESMP在C18柱上的色谱保留行为，色谱分离数据见表1。

表1 流动相组成对分离的影响Tab.1 Effect of mobile phase composition on separation

流动相A/流动相B（V/V）=20/80时，DESMP的保留时间短，与相邻物质的分离度仅为1.10，小于1.5，DESMP与相邻物质无法分离；流动相A/流动相B（V/V）=40/60时分离度为2.40，已经基本实现完全分离；随着流动相中甲醇含量减少，DESMP在C18柱上的保留时间增加，与相邻干扰物质的分离度增加，流动相A/流动相B=50/50（V/V）时分离度为7.85，DESMP保留时间为13.208min，在此流动相组成条件下DESMP与干扰物质可以实现基线分离，考虑到废水组分的复杂性，最终选择H3PO4（0.1%）水溶液/甲醇为50/50（V/V）为流动相，等度洗脱。在此流动相组成条件下，DESMP样品分离色谱图见图1，DESMP保留时间13.208min，色谱柱效n=8270，与相邻干扰物质分离度为7.85，可完全分离。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of DESMP

2.2 检测波长选择

采用LC-100紫外检测器对DESMP在200～300nm波长范围内进行紫外光谱扫描，紫外吸收光谱见图2。

图2 DESMP紫外吸收光谱Fig.2 UV absorption spectra of DESMP

由图2可知，DESMP在210～300nm波长范围内有两个宽带吸收，210～240nm有强的吸收谱带，摩尔吸光系数大，灵敏度高；250～280nm处有弱吸收谱带，摩尔吸光系数小。DESMP分子中磺酰氧基与苯环存在共轭，使分子中苯环E2带吸收发生红移，最大吸收波长为230nm。E2谱带摩尔吸光系数较大，灵敏度相对较高，因此，试验选择230nm作为方法检测波长。

2.3 标准曲线与最小检测浓度

分别准确移取0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、8.00mL标准储备液，置于50mL容量瓶中，用50%流动相A与50%流动相B的混合液稀释至刻度，混匀，配制6个浓度梯度的标准溶液，DESMP的浓度分别为1.24、2.48、6.21、12.42、24.83、49.66mg·L-1。按仪器工作条件进行色谱分析，以浓度C（mg·L-1）横坐标，峰面积A（mAU·s）为纵坐标绘制标准曲线，见图3。

图3 DESMP标准曲线Fig.3 Standard curve of DESMP

由图3可知，DESMP标准曲线回归方程A=47.186×C+13.711，相关系数r=0.9999，在1.24～49.66mg·L-1浓度范围内线性关系良好。以浓度1.24mg·L-1DESMP标准溶液测定方法最小检测浓度Cmin，在液相色谱条件下进样20μL，测得DESMP色谱峰高2.53×10-3AU，仪器短期基线噪声7.0×10-6AU，按《GB/T 26792-2019高效液相色谱仪》规定方法计算，方法最小检测浓度Cmin=6.86×10-3mg·L-1。

2.4 精密度试验

平行移取0.50mL试样6份，按照试验方法进行样本处理，外标法定量分析，测试数据及定量分析结果见表2。

表2 精密度试验结果（n=6）Tab.2 Results of tests for precision（n=6）

2.5 回收率试验

精密移取已知DESMP含量的试验样品0.50mL于100mL容量瓶中，再分别加入DESMP储备液0.50，2.00，8.00mL，流动相稀释至刻度，混匀，进行低、中、高3种浓度水平的加标试验，每个浓度水平的样品进行6次平行测定，计算平均加标回收率和测定结果的相对标准偏差（RSD），结果见表3。

表3 回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of tests for recovery（n=6）

由表3可知，DESMP加标回收率为98.85%～101.59%，RSD为1.14%～2.46%。

2.6 样品测定

对某企业生产DESMP工艺废水进行6批次采样，按照试验方法进行测定，废水中DESMP含量在320～810mg·L-1范围内变化，说明企业工艺生产基本稳定。分析方法的建立为DESMP工艺条件优化及废水处理工艺研究提供了参考依据，同时也为企业产品质量控制提供了可靠保障。

3 结论

本工作建立了替诺福韦生产工艺废水中DESMP含量测定的高效液相色谱法。方法具有简单、快速、重复性好的优点，方法的线性范围宽，检出限低，重现性和准确度均能满足废水中DESMP含量的测定，测试方法亦可以用于生产工艺条件的优化。