响应面优化超声辅助提取花椒生物碱工艺*

郑 丹，王莎莎

（1.咸阳职业技术学院，陕西 咸阳 712000；2.四川省资阳市环境保护局，四川 资阳 641300）

花椒是一种食药两用原料，其提取物生物碱因良好的抗氧化性、抑菌活性、抗炎、镇痛、杀虫、抑制血小板凝集、抗肿瘤、抗疟疾等已被广泛应用于制药、食品、化妆品行业[1,2]。超声辅助提取天然产物已被广泛应用[3,4]。目前，生物碱的常用测定方法为高效液相色谱法[5-7]，其测定虽准确，但耗时长，费用高，前处理较为繁琐，不适宜快速检测含量。分光光度法操作简单，尤其当分析样本数量较大时，其简便、快速、可靠的特性更具实际意义，因此，在定量分析生物碱类化合物含量中应用广泛。本文运用超声辅助提取技术，结合中心复合设计响应面分析处理方法优化花椒提取工艺参数，旨在为其实验研究和工业应用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

白屈菜红碱标准品（中国药品生物制品检定所）；韩城大红袍花椒（2020年产，干燥至恒重，粉碎备用）；无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂）、三氯甲烷（成都市科龙化工试剂厂）、HCl（国药集团化学试剂有限公司），以上试剂均为优级纯。

KH-300DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FW-100型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 花椒生物碱提取方法 采用乙醇浸泡辅助超声提取[8]。在锥形瓶中准确称取1.00g花椒粉末，加入乙醇浸泡后超声提取。提取液经砂芯漏斗抽滤，吸取5mL滤液水浴蒸干后加入5%HCl溶液溶解，过滤，滤液经氯仿多次萃取，分离氯仿层，水浴蒸干后加无水乙醇溶解，过滤，50mL容量瓶定容。

1.2.2 单因素实验 保持其他条件不变，逐步考察单一因素对花椒生物碱提取率的影响。

1.2.3 Plackett-Burman实验 Plackett-Burman实验（“-1”为低水平，“+1”为高水平）[9]。在单因素基础上，从料液比（A）、超声时间（B）、浸泡时间（C）、超声功率（D）、超声温度（E）、提取次数（F）、乙醇浓度（G）中筛选显著影响花椒生物碱提取率的因子。

Plackett-Burman实验设计因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman实验设计因素水平Tab.1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.4 响应面优化方法 中心复合响应面分析法是考察响应值与影响因素之间的关系，是一种非线性的多项式模式，用来估计一阶、二阶与一阶相互交互作用[10]。继单因素实验、Plackett-Burman实验后，得知料液比（A）、超声功率（D）、乙醇浓度（G）为花椒生物碱提取率的显著影响因素，进一步采用响应面分析优化各因素对响应值的影响。中心复合实验设计因素水平见表2。

表2 中心复合实验设计因素水平Tab.2 Factors and levels in response surface design

1.3 标准曲线的制作

向盛有5.00mg白屈菜红碱标准品的小烧杯中加入无水乙醇，经溶解、定容后，配制成0.200mg·mL-1的标准品溶液25mL，分别量取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL标准品溶液配制成20.00，30.00，40.00，50.00，60.00，70.00，80.00μg·mL-1溶液各10mL，在425nm处测定A，绘制标准曲线:A=0.0085ρ-0.0187，R2=0.9996。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验初选提取条件

2.1.1 料液比对花椒生物碱提取率的影响 采用1.2.1花椒生物碱提取方法，保持其他条件不变，料液比与花椒生物碱提取率的关系见图1。

图1 料液比对花椒生物碱提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of alkaloids

由图1可知，当料液比小于1∶20，花椒生物碱提取率随着料液比的增加逐渐增大；当料液比大于1∶20，花椒生物碱在乙醇中的溶出率趋缓，考虑到节能、环保，选用料液比1∶20为后续实验的参考值。

2.1.2 超声时间对花椒生物碱提取率的影响 采用1.2.1花椒生物碱提取方法，保持其他条件不变，考察超声时间对花椒生物碱提取率的影响，见图2。

图2 超声时间对花椒生物碱提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic on extraction yield of alkaloids

由图2可知，5~20min，花椒生物碱提取率随着超声时间增加而增大，20min达到最大值，超过20min后花椒生物碱的提取率反而下降，可能是由于花椒生物碱的溶出趋于饱和，且超声破坏了花椒生物碱中的不稳定成分。因此，选用超声20min作为后续实验的参考值。

2.1.3 浸泡时间对花椒生物碱提取率的影响 采用1.2.1花椒生物碱提取方法，保持其他条件不变，超声提取前浸泡时间与花椒生物碱提取率之间的关系，见图3。

图3 浸泡时间对花椒生物碱提取率的影响Fig.3 Effect of soak time on extraction yield of alkaloids

由图3可知，花椒生物碱提取率随着超声前浸泡时间增加呈先增大后减小，在浸泡时间50min时，花椒生物碱提取率最大，此时花椒生物碱的溶出趋于饱和，因此，选用浸泡时间50min作为后续实验的参考值。

2.1.4 超声功率对花椒生物碱提取率的影响 采用1.2.1的提取方法，考察超声功率与花椒生物碱的关系，见图4。

图4 超声功率对花椒生物碱提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction yield of alkaloids

由图4可知，在超声功率40~80W，花椒生物碱的提取率随超声功率的增大而增大，但当超声功率大于80W时，过大的超声功率使花椒中的色素、脂溶性等成分不断溶出，生物碱成分被破坏，因而，生物碱的提取率逐渐下降。因此，选用超声功率80W作为后续实验的参考值。

2.1.5 超声温度对花椒生物碱提取率的影响 采用1.2.1的提取方法，考察超声温度与花椒生物碱提取率的关系，见图5。

图5 超声温度对花椒生物碱提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of alkaloids

由图5可知，花椒生物碱提取率随超声温度的增大呈先增大后减小。在超声温度30~70℃，花椒生物碱提取率随着超声温度的升高逐渐增大，在超声温度达70℃时，生物碱提取率最大。当提取温度继续升高，花椒生物碱结构不稳定，易被破坏，且杂质溶出增多，花椒生物碱提取率下降。因此，选用超声温度70℃作为后续实验的参考值。

2.1.6 提取次数对花椒生物碱提取率的影响 采用1.2.1的提取方法，考察提取次数与花椒生物碱关系，见图6。

图6 提取次数对花椒生物碱提取率的影响Fig.6 Effect of extracting times on extraction yield of alkaloids

由图6可知，花椒生物碱提取率随着提取次数的增加而增大，当提取次数达到两次后，花椒生物碱的提取率变化不大，说明此时花椒生物碱的有效成分已基本提取完成，考虑到经济、时间成本，选用提取次数两次作为后续实验的参考值。

2.1.7 乙醇浓度对花椒生物碱提取率的影响 采用1.2.1花椒生物碱提取方法，保持其他条件不变，考察乙醇浓度对花椒生物碱提取率的影响，见图7。

图7 乙醇浓度对花椒生物碱提取率的影响Fig.7 Effect of ethanol concentration on extraction yield of alkaloids

由图7可知，花椒生物碱提取率随乙醇浓度的增大呈先增大后减小，在乙醇浓度为70%时，出现拐点。这是因为随溶液浓度增大，溶液极性与生物碱极性越接近时，根据相似相溶原理，花椒生物碱溶出率增大。因此，选用与生物碱极性最为接近的70%的乙醇浓度作为后续实验的参考值。

2.2 显著影响因子的筛选

进行12组Plackett-Burman实验，每组实验取3次重复实验的平均值，见表3。

表3 Plackett-Burman实验设计及响应值Tab.3 Plackett-Burman test design and result

PB实验数据经Minitab15进行回归模型方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression equation

由表4可知，P=0.002，小于0.05，表明回归拟合显著，具有统计学意义。

料液比（A）、超声功率（D）、乙醇浓度（G）是影响花椒生物碱提取率主要因素，见表5和图8、9。

图8 影响因素的标准化效应的Pareto图（响应为C12,Alpha=.05）Fig.8 Pareto diagram of standardization of influencing factors

表5 偏回归系数及显著性检验Tab.5 Partial regression coefficients and significance test

回归得到多元一次方程为Y=9.627+0.576A+0.223B+0.251C-1.068D+0.198E-0.183F+1.266G

图9 影响因素的标准化效应的正态图（响应为C12,Alpha=.05）Fig.9 Normal graph of the standardization effect of influencing factors

2.3 非线性优化工艺条件

2.3.1 中心复合实验结果 经过单因素初步优化及显著性筛选试验后，选取料液比（A）、超声功率（D）、乙醇浓度（G）3个对花椒生物碱提取效果显著的因素，将3因素的最优值作为中心复合实验的中心点，选取中心点6个，析因点14个，进行响应面优化实验。设计方案及结果见表6。

表6 中心复合试验设计方案及响应值Tab.6 Experiment design and result of response surface design

2.3.2 实验结果回归模型方差分析 表6实验数据经Minitab15分析后，得到生物碱提取率Y与自变量A、D和G的关系的多元二次回归方程：

Y＝0.079A-0.009D-0.047G-0.302A2-0.258D2-0.120G2-0.074AD-0.019AG-0.0088DG+12.867，回归方程显著性检验见表7。

表7 回归系数显著性检验表Tab.7 Significance test table of regression coefficient

由表7可知，一次项料液比A，二次项料液比A2、超声功率D2、乙醇浓度G2，交互项料液比与超声功率AD等对生物碱的提取影响显著。

表8为回归方程方差分析。

表8 回归方程方差分析Tab.8 Analysis of variance of regression equation

由表8可知，模型中F＝84.25大于F0.01（9,5）＝10.2，P小于0.001，表明该模型中有显著的影响因子；对线性进行分析，P=0.001表明料液比、超声功率、乙醇浓度对花椒生物碱提取率的影响不是简单的线性关系。对模型进行可信分析，得到复相关系数R2=97.40%，表明该模型能够解释97.40%生物碱含量的影响因素，该模型拟合较好。Y的变异系数较低，验证该实验的变异程度低、精确度高。综上所述，该实验能够很好的模拟生物碱的提取。

2.3.3 非线性回归模型拟合最优条件的确定 对上述非线性回归模型拟合分析，得生物碱的最佳提取量的条件：A=0.1515，D=0，G=-0.03030，Y=59.4841。所以与之对应的花椒生物碱得率最高时的提取条件组成为：料液比为1∶20，超声功率80W，乙醇浓度70%。

3 结论

经单因素、Plackett-Burman实验后，进一步采用中心复合实验优化提取花椒生物碱影响因素和水平，并建立数学模型，得出料液比为1∶20、超声功率80W、乙醇浓度70%为花椒生物碱最佳提取工艺，及此工艺条件下花椒生物碱含量为12.48mg·g-1。采用超声辅助提取技术，耗时短、操作简便，拓宽了花椒功能研究的途径。