基于化学模式识别的不同产地金银花HPLC指纹图谱研究

刘天亮，杨林林，董诚明，高启国，齐大明，徐晓丽，李江华

基于化学模式识别的不同产地金银花HPLC指纹图谱研究

刘天亮1, 2，杨林林1, 2*，董诚明1, 2*，高启国3，齐大明1, 2，徐晓丽3，李江华3

1. 河南中医药大学，河南 郑州 450046 2. 河南省道地药材生态种植工程技术研究中心，河南 郑州 450046 3. 河南太龙药业股份有限公司，河南 郑州 450001

建立道地产区及不同主产区金银花HPLC指纹图谱，结合化学计量学评价为金银花质评质控体系的构建及其潜在质量标志物的探索提供参考和依据。采集河南、山东、河北产区的金银花样品，优化提取与检测方法，建立最佳HPLC指纹图谱条件。色谱柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱条件，进样体积10 μL；检测波长245 nm；体积流量0.5 mL/min；柱温38 ℃。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723）对HPLC图谱数据进行共有峰确定、相似度评价。采用SIMCA-P 14.1软件进行聚类分析（cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。3个产地金银花HPLC指纹图谱共匹配45个共有峰成分，标示出16个色谱峰。HCA与PCA结果可将河南产区与山东、河北产区金银花样品完全区分。OPLS-DA分析结果表明异绿原酸B、香豆酸、莫诺苷、芦丁、新绿原酸、断氧化马钱苷等物质含量在河南产金银花样品中普遍高于山东、河北产金银花；绿原酸、异绿原酸C、木犀草苷在山东产金银花样品中普遍高于河南、河北产金银花；忍冬苷在河北产金银花样品中普遍高于河南、山东产金银花。所建立的金银花HPLC指纹图谱结合化学计量学的方法，可应用于金银花质量标准的研究与开发及其潜在质量标志物和道地因子的探索。

金银花；指纹图谱；主成分分析；正交偏最小二乘法判别分析；异绿原酸B；香豆酸；莫诺苷；芦丁；新绿原酸；忍冬苷；断氧化马钱苷

金银花为忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，因其临床疗效显著、使用范围较广，素有“植物抗生素”的美誉，具有较高的药用价值和经济价值，且收录于国家卫健委发布的药食同源目录。在“保健养生”的消费需求和国家政策的共同推动下，作为特殊农业范畴的中药生态农业，成为了中药GAP的未来趋势，加之农业部农业供给侧结构性改革规划，我国政府愈发重视传统道地药材生产技术及中药材产地、品质、市场等相关问题[1-3]。

中药材大多是药用植物，易受生长环境、土壤、气候等资源禀赋的影响。中医历来十分重视道地药材，对道地药材的研究不仅推动了中药鉴定学和生药学的发展，更是促进了中药材优质优价、高产高效的发展[4-5]。近20年，我国中药材种植面积稳中有升，中药的质量控制和评价也逐渐演变成为制约中药现代化发展的关键因素之一，“产-学-研”等关键角色的联系不够紧密甚至脱节，导致市场部分中药材存在着产量、品质、价格等方面良莠不齐的现象，不同程度上影响了中医临床使用的疗效。另外，以中药材为原料的食品、保健品、化妆品消费快速增长，生产安全面临严峻挑战。

中药质控的现行目标是保证中药材或制剂的一致性和稳定性，而指纹图谱技术可分析中药中有效成分和无效成分的种类和含量分布的信息，符合中医中药整体性和模糊性的特点，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式。至今，色谱指纹图谱在中药质量控制体系的各个方面物尽其用，包括真实性鉴定（化学指纹图谱）、有效性评价（谱效学、生物指纹图谱、代谢指纹图谱）和安全性评价[6-8]。同时，模式识别技术是化学计量学的重要组成部分，也是筛选中药质量标志物的重要数学方法，而指纹图谱结合模式识别方法在中药鉴别、定性表征、质量控制、组效关系等研究中均具有广泛应用[9-10]。

目前，已建立的金银花色谱指纹图谱多存在着样本单一不具有代表性、色谱基线漂移、分离峰数较少甚至错误指认等方面的缺点，样品提取方法及色谱检测方法仍有极大的优化空间[11-15]。因此，建立一种重现性良好、稳定性可靠、分辨率清晰，同时适用于不同产地金银花的品质评价或不同种属真伪鉴别的指纹图谱分析方法迫在眉睫。

本研究采集了河南、河北、山东3大产区的65个批次的金银花样品，优化了提取与检测方法，建立了基线平稳、稳定性好、分辨率高的HPLC指纹图谱，并对金银花中有机酸类、环烯醚萜类、黄酮类等共16种化学成分进行归属，结合化学模式识别技术，客观地反映了药材品质的整体性与差异性，为金银花道地因子的研究、评价体系的构建，市场真伪的鉴别提供了基础手段，同时对金银花质量标志物的探索提供了新的思路与方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695-2489型高效液相；Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，美国沃特斯公司；IMS105DU型万分之一天平，瑞士梅特勒-托利多集团；KQ-500DV型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FW135型粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司等。

1.2 材料

绿原酸（批号PS0131-0025）成都普思生物科技股份有限公司；咖啡酸（批号MUST-16060613）、莫诺苷（批号MUST-15102911），成都曼思特生物科技有限公司；断马钱子酸（批号DST190719-136）、忍冬苷（批号DST190708-048）、异槲皮素（批号DST191012-006），成都德思特生物技术有限公司；断氧化马钱苷（批号P27N8L49194）、木犀草苷（批号Y26A9H59973），上海源叶生物科技有限公司；新绿原酸（批号wkq18030107）、异绿原酸A（批号wkq18041207）、异绿原酸B（批号wkq19012301）、异绿原酸C（批号wkq18050905）、阿魏酸（批号wkq18042309）、芦丁（批号wkq16101104）、当药苷（批号wkq18042610），四川省维克奇生物科技有限公司。所用对照品质量分数均≥98%；甲醇、乙腈为色谱级，水为超纯水，其余均为分析纯。

65批金银花样品取自于河南、山东、河北各地，详细信息见表1，经河南中医药大学生药学科董诚明教授鉴定为忍冬科植物忍冬Thunb.。

表1 金银花样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱条件：0～10 min，8%～9% A；10～25 min，9%～11% A；25～35 min，11%～15% A；35～50 min，15%～16% A；50～65 min，16%～20% A；65～75 min，20%～24% A；75～80 min，24%～38% A；进样体积10 μL；检测波长245 nm；体积流量0.5 mL/min；柱温38 ℃。

2.2 提取工艺优化

2.2.1 提取料液比对结果的影响 采用50%甲醇为提取液，超声提取（功率250 W、频率35 kHz），提取时间30 min，提取料液比分别为1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100、1∶200共6份样品，提取后在245 nm，体积流量0.5 mL/min，柱温38 ℃色谱条件下测定结果，考察不同料液比对金银花HPLC指纹图谱的影响，得最佳提取料液比为1∶50，结果见图1。

a-料液比1∶10 b-料液比1∶25 c-料液比1∶50 d-料液比1∶75 e-料液比1∶100 f-料液比1∶200

2.2.2 提取液甲醇体积分数对结果的影响 采用超声提取（功率250 W，频率35 kHz），提取时间30 min，料液比1∶50，提取液水及甲醇浓度分别为10%、25%、50%、75%、100%共6份样品，提取后在245 nm，体积流量0.5 mL/min，柱温38 ℃色谱条件下测定结果，考察不同甲醇体积分数对金银花HPLC指纹图谱的影响，得最佳提取溶剂为50%甲醇，结果见图2。

2.2.3 提取时间对结果的影响 采用超声提取（功率250 W、频率35 kHz），料液比1∶50，提取液甲醇体积分数为50%，提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min共6份样品，提取后在245 nm，体积流量0.5 mL/min，柱温38 ℃色谱条件下测定结果，考察不同提取时间对金银花HPLC指纹图谱的影响，得最佳提取时间为30 min，结果见图3。

a-水 b-10%甲醇 c-25%甲醇 d-50%甲醇 e-75%甲醇 f-100%甲醇

a-10 min b-20 min c-30 min d-40 min e-50 min f-60 min

综上，由图1～3可知，最佳提取工艺为采用50%甲醇为提取液，料液比1∶50，超声提取（功率250 W，频率35 kHz），提取时间30 min。

2.3 检测方法优化

2.3.1 检测波长对结果的影响 采用50%甲醇为提取液，料液比1∶50，超声提取（功率250 W、频率35 kHz），提取时间30 min，提取后分别在260 nm（a）、255 nm（b）、250 nm（c）、245 nm（d）、240 nm（e）、235 nm（f）、230 nm（g）、225 nm（h）、220 nm（i）、215 nm（j），体积流量0.5 mL/min，柱温38 ℃色谱条件下测定结果，考察不同检测波长对金银花HPLC指纹图谱的影响，得最佳检测波长为245 nm，结果见图4。

a-260 nm b-255 nm c-250 nm d-245 nm e-240 nm f-235 nm g-230 nm h-225 nm i-220 nm j-215 nm

2.3.2 色谱柱温对结果的影响 采用50%甲醇为提取液，料液比1∶50，超声提取（功率250 W，频率35 kHz），提取时间30 min，提取后在245 nm，体积流量0.5 mL/min，柱温分别为30 ℃（a）、32 ℃（b）、34 ℃（c）、36 ℃（d）、38 ℃（e）、40 ℃（f）色谱条件下测定结果，考察不同色谱柱温对金银花HPLC指纹图谱的影响，得最佳检测柱温为38 ℃，结果见图5。

a-30 ℃ b-32 ℃ c-34 ℃ d-36 ℃ e-38 ℃ f-40 ℃

2.3.3 进样体积流量对结果的影响 采用50%甲醇为提取液，料液比1∶50，超声提取（功率250 W，频率35 kHz），提取时间30 min，提取后分别在245 nm，柱温38 ℃，体积流量分别为0.1 mL/min（a）、0.2 mL/min（b）、0.3 mL/min（c）、0.4 mL/min（d）、0.5 mL/min（e）、0.6 mL/min（f）、0.7 mL/min（g）、0.8 mL/min（h）、0.9 mL/min（i）、1.0 mL/min（j）色谱条件下测定结果，考察不同进样体积流量对金银花HPLC指纹图谱的影响，得最佳体积流量为0.5 mL/min，结果见图6。

a-0.1 mL/min b-0.2 mL/min c-0.3 mL/min d-0.4 mL/min e-0.5 mL/min f-0.6 mL/min g-0.7 mL/min h-0.8 mL/min i-0.9 mL/min j-1.0 mL/min

综上，由图4～6可知，最佳检测方法为：检测波长245 nm，体积流量0.5 mL/min，柱温38 ℃。

2.4 溶液的制备

2.4.1 对照品溶液 分别精密称定香豆酸、新绿原酸、莫诺苷、绿原酸、断马钱子酸、咖啡酸、当药苷、断氧化马钱苷、阿魏酸、芦丁、异槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C，以50%甲醇溶解配制成质量浓度分别为0.590、0.252、0.966、0.480、0.396、0.420、1.172、0.314、0.352、0.954、0.271、0.373、0.284、0.448、0.430、0.672 mg/mL的储备液，另分别取各储备液适量，以50%甲醇定容至5 mL作为混合对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液 根据“2.2提取工艺优化”项下结果，精密称取金银花粉末1 g置锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL，称定并记录重量，超声提取30 min（功率250 W，频率35 kHz），冷却后以50%甲醇补足失重，摇匀过滤，即得。

2.5 样品测定

根据“2.3”项下结果，取65批金银花，按“2.4.2”项制备供试品溶液，在检测波长245 nm，体积流量0.5 mL/min，柱温38 ℃色谱条件下，进样10 μL进行测定，得金银花混合对照品图谱及样品指纹图谱见图7。

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 取金银花供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，以8号峰断氧化马钱苷为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果表明16个共有峰的相对保留时间RSD为0.06%～0.25%，相对峰面积RSD为0.16%～1.93%。

1-香豆酸 2-新绿原酸 3-莫诺苷 4-绿原酸 5-断马钱子酸 6-咖啡酸 7-当药苷 8-断氧化马钱苷 9-阿魏酸 10-芦丁 11-异槲皮素 12-木犀草苷 13-忍冬苷 14-异绿原酸B 15-异绿原酸A 16-异绿原酸C

1-cumalic acid 2-neochlorogenic acid 3-morroniside 4-chlorogenic acid 5-secologaninsaeure 6-caffeic acid 7-sweroside 8-secoxyloganin 9-ferulic acid 10-troxerutin 11-isoquercetin 12-cynaroside 13-xylostein 14-isochlorogenic acid B 15-isochlorogenic acid A 16-isochlorogenic acid C

图7 金银花样品(a)及混合对照品(b) HPLC图谱

Fig. 7 HPLC profile ofsample (a) and mixed reference substance (b)

2.6.2 重复性试验 按“2.4.2”项下平行称取6份金银花样品，分别制备成供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定。以8号峰断氧化马钱苷为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果表明16个共有峰的相对保留时间RSD为0.17%～0.58%，相对峰面积RSD为1.52%～4.02%。

2.6.3 稳定性试验 取金银花供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别在0、4、8、16、20、24、48 h进样，以断氧化马钱苷为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果表明16个共有峰的相对保留时间RSD为0.13%～0.82%，相对峰面积RSD为0.75%～4.62%。

2.7 数据处理

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723）对HPLC图谱数据进行共有峰确定、相似度评价；用SIMCA-P 14.1软件进行聚类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，）。

2.8 化学计量学分析

2.8.1 不同产地金银花HPLC指纹图谱的建立采用ChemPattern_v1.0绘制各产地金银花样品叠加图谱，见图8～10；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723）分别对各产地金银花HPLC指纹图谱进行共有峰确定及相似度评价，以平均数法生成对照图谱，时间窗宽度0.5。经全谱峰匹配后生成对照图谱，见图11，各产地不同批次金银花样品HPLC图谱与对照图谱相似度结果见表2。

图8 31批河南产区金银花HPLC指纹图谱

图9 19批山东产区金银花HPLC指纹图谱

图10 15批河北产区金银花HPLC指纹图谱

由结果可知，31批河南产区金银花HPLC指纹图谱匹配共有峰67个，其中第11、13、16、19、21、22、29、37、40、44、47、48、51、55、56、65号峰分别对应为香豆酸、新绿原酸、莫诺苷、绿原酸、断马钱子酸、咖啡酸、当药苷、断氧化马钱苷、阿魏酸、芦丁、异槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C，与对照图谱相似度范围在0.883～0.995，除HN9、HN7之外相似度范围在0.963～0.995；19批山东产区金银花HPLC指纹图谱匹配共有峰52个，其中第8、9、14、17、20、21、25、29、32、35、38、39、40、43、44、48号峰分别对应为香豆酸、新绿原酸、莫诺苷、绿原酸、断马钱子酸、咖啡酸、当药苷、断氧化马钱苷、阿魏酸、芦丁、异槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C，与对照图谱相似度范围在0.905～0.997；15批河北产区金银花HPLC指纹图谱匹配共有峰61个，其中第12、15、18、20、24、25、33、38、41、44、45、47、49、55、56、60号峰分别对应为香豆酸、新绿原酸、莫诺苷、绿原酸、断马钱子酸、咖啡酸、当药苷、断氧化马钱苷、阿魏酸、芦丁、异槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C，与对照图谱相似度范围在0.993～0.995。

图11 河南(a)、山东(b)、河北(c) 产区金银花HPLC对照指纹图谱

表2 金银花HPLC指纹图谱相似度结果

2.8.2 HCA及PCA 采用SIMCA-P 14.1软件对河南、山东、河北3个产地的金银花样品HPLC图谱结果进行HCA、PCA，为了使结果能够最大程度地反映样本信息，数据分析时，选用各产地间所匹配的全部共有峰进行计算，包括16个已标示出的共有峰，各产地金银花样本聚类分析结果见图12，主成分分析得分图见图13，各产地金银花样本主成分分析特征值及方差贡献率见表3～5。

图12 河南(a)、山东(b)、河北(c)各产区金银花HPLC指纹图谱HCA结果

图13 河南(a)、山东(b)、河北(c) 各产区金银花HPLC指纹图谱PCA结果

表3 河南产区金银花样品主成分分析特征值及方差贡献率

表4 山东产区金银花样品主成分分析特征值及方差贡献率

表5 河北产区金银花样品主成分分析特征值及方差贡献率

由结果可知，31批河南产金银花样本聚类结果分为2类，且2类样本整体分布集中，主成分分析自动拟合5个主成分，特征值均大于1，累积方差贡献率74.5%；19批山东产金银花聚类结果整体分为3类，其中1类分布较为集中，其余2类较为离散，主成分分析自动拟合4个主成分，特征值均大于1，累积方差贡献率72.6%；15批河北产金银花聚类结果整体分为2类，但2类样本均分布较为离散，主成分分析自动拟合5个主成分，其中前4个主成分特征值大于1，累积方差贡献率86.3%。

为更好地区分不同产地金银花样品之间的差异，根据HCA及PCA结果，在各产地不同批次样本中分别筛选出10批相似度接近，综合得分分布集中的样品，使其更能代表其产地信息，进行更为细致深入的分析，以3个产地共有峰交集数据（共计匹配45个共有峰，包括16个已标示的共有峰），导入IBM SPSS Statistics 20.0软件进行聚类分析，聚类方法采用组间连接法，聚类距离为欧氏平方距离，结果见图14，绘制3个产区金银花HPLC指纹图谱PCA得分图，见图15。

由图14可知，当聚类距离等于20时，3个产地30批次样品整体分为2类，其中河南产地10批样品聚为1类，山东产地与河北产地20批样品聚为1类；当聚类距离等于10时，山东与河北产地金银花样品分为2类，其中SD7与河北10批样品聚为1类，剩余山东9个批次样品聚为1类；主成分分析结果与聚类结果基本一致，可以看出河南产金银花样品综合得分整体分布集中，且可与山东、河北金银花样品完全区分，山东产金银花样品综合得分分布相对离散，河北产金银花样品综合得分分布较为集中但与山东产金银花有部分重叠，无法完全区分。

图14 3个产区金银花HCA结果

图15 3个产区金银花PCA结果

2.8.3 OPLS-DA 不同于PCA，OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法，该方法基于OPLS，使分类信息主要集中在主成分上，建立样品类别之间的关系模型，并且使模型易于解释，其判别效果及主成分得分图的可视化效果更加明显。近年来，这种方法在理论和应用方面得到了迅速地发展，并在计量化学中有大量的应用，而在其相关的中药领域应用更加广泛，常作为生药质量评价、中药炮制前后成分差异研究、中药药理代谢组学及中药潜在质量标志物探索的基础方法之一[16-18]。

断氧化马钱苷为金银花中环烯醚萜苷类成分之一，现代药理学研究表明其作用较绿原酸及木犀草苷而言，更贴合金银花传统临床应用功效，且具有保肝利胆等作用[19]，因其色谱峰位置居中，在各批次样品中的稳定性最好且具有良好的分离度，故选取其为参照峰。以河南产金银花样品为对照组，将30批样品16个共有峰数据导入SIMCA-P 14.1软件分别建立两两分组比较的OPLS-DA模型。模型参数和分别表示所建模型对和矩阵的解释率，2表示模型的预测能力，变量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）表示差异成分对各组样本分类判别的影响强度和解释能力（通常以VIP值＞1作为筛选标准），OPLS-DA得分图的横坐标表示组间的差异，纵坐标表示组内的差异。河南-山东产金银花判别模型（M1）与河南-河北产金银花判别模型（M2）见图16、17，VIP值见图18、19。

由结果可知，河南-山东产金银花判别模型（M1），2＝0.813，RY＝0.984，Q2＝0.975，表明所建立的模型解释率和预测力良好、可靠，结合VIP值可知，VIP大于1的成分有异绿原酸A、异绿原酸B和绿原酸；河南-河北产金银花判别模型（M2），RX＝0.855，RY＝0.990，2＝0.980，表明所建立的模型解释率良好，预测力可靠，结合可知，异绿原酸B＞异绿原酸A＞绿原酸＞1。

图16 河南-山东金银花OPLS-DA分析得分图

图17 河南-河北金银花OPLS-DA分析得分图

图18 河南-山东金银花变量VIP

图19 河南与河北金银花变量VIP

另外，研究或比较2个OPLS模型之间所共同的或独特的差异化合物，可以通过共享与特有化合物结构分析图（Shared and unique structure-plot, SUS-plot）来实现，将2个OPLS模型进行对比分析，研究其中化合物在2个模型中的变化趋势的异同性[20]。在2个模型中变化趋势一致或者相反的化合物，2个模型所特有的化合物分别出现在平面坐标轴不同象限的特定区域，便于发现、归类和分析。以河南-山东产金银花判别模型（M1）为纵坐标（），以河南-河北产金银花判别模型（M2）为横坐标（），绘制3个产区金银花样品共享与特有化合物结构分析图（SUS-plot），见图20。

由图20可知，其第1、2象限对应河南-山东产金银花判别模型（M1）正方向，结合图16“河南与山东金银花判别OPLS-DA分析得分图”可知山东产金银花样品分布于模型（M1）的正方向，因此图20中第1、2象限中所示化合物成分在山东产金银花样品中普遍高于河南产金银花样品，第3、4象限所标示化合物成分普遍低于河南产金银花样品；同理可得，结合图17“河南-河北金银花判别OPLS-DA分析得分图”可知河北产金银花样品分布于模型（M2）的正方向，其第1、4象限对应河南-河北产金银花判别模型（M2）正方向，因此图20中第1、4象限中所示化合物成分在河北产金银花样品中普遍高于河南产金银花样品，第2、3象限所标示化合物成分普遍低于河南产金银花样品。综上所述，即在图20中第1象限所示成分（异绿原酸A、当药苷、咖啡酸、阿魏酸）在河南产金银花样品中普遍低于山东、河北产金银花；第2象限所示成分（绿原酸、异绿原酸C、木犀草苷）在山东产金银花样品中普遍高于河南产金银花，河南产金银花普遍高于河北产金银花；第3象限所示成分（异绿原酸B、香豆酸、莫诺苷、芦丁、新绿原酸、断氧化马钱苷）在河南产金银花样品中普遍高于山东、河北产金银花；第4象限所示成分（忍冬苷）在河北产金银花样品中普遍高于河南产金银花，河南产金银花普遍高于山东产金银花。

图20 3个产区金银花样品共享与特有化合物结构分析图（SUS-plot）

3 讨论

本研究根据市场调研，依据产地种植面积、种植密度，采集了河南、山东、河北3个主产区的65批金银花样品，使取样具有真实性、代表性；系统考察了提取溶液甲醇体积分数、料液比、提取时间、检测波长、体积流量、柱温等条件，建立了重现性良好、稳定性可靠、分辨率清晰的适用于不同产地金银花品质评价的HPLC指纹图谱条件，并结合化学识别模式建立了拟合信息丰富、预测能力优良、判别能力精准的不同产地的数学模型。

在对不同产地批次的金银花HPLC指纹图谱结果进行分析的过程中，根据研究目的采取了逐步分析的方法，首先建立起不同产地HPLC指纹图谱，对产地内不同批次的样品，以匹配到的全部共有峰作为数据源进行聚类分析及主成分分析，使其分析结果在极大程度上反映了样本的真实信息及产地内金银花商品品质的稳定性，可以看出河南产金银花品质相对来说更加稳定集中，而山东和河北产金银花品质相对分布离散。然后，根据产地内初步的分析结果，进行了样本的筛选，每个产地之中选出10个分布最为集中的批次，目的是在保证数据具有统计学意义及样本代表性的前提下，使所筛选出的金银花样品最能代表产地特征，再进行产地间的判别分析，在对产地间金银花HPLC指纹图谱进行分析时，通过共享与特有化合物结构分析，数据选用已标示的16个共有峰成分，使结果具有可行性及可验证性。

HPLC指纹图谱技术与化学模式识别技术结合起来能体现出更多的样本信息，并且在评价药材质量和质量控制上显示了此法的适用性。通过对指纹图谱进行化学计量学分析，可以客观地反映了药材品质的整体性与差异性，且本研究所建立的方法与模型，同样可以应用于金银花不同品种、不同部位、不同采收时期及不同加工方式的品质研究，为其种质种源评价、综合开发利用、原料药稳定性及加工方式优化提供研究基础和方法，为优质金银花规范化生产基地建设及其潜在中药质量标志物的探索提供参考和依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on HPLC fingerprint offrom different areas based on chemical pattern recognition

LIU Tian-liang1, 2, YANG Lin-lin1, 2, DONG Cheng-ming1, 2, GAO Qi-guo3, QI Da-ming1, 2, XU Xiao-li3, LI Jiang-hua3

1. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Provincial Ecological Planting Engineering Technology Research Center of Authentic Medicinal Materials, Zhengzhou 450046, China 3. Taloph Pharmaceutical Co., Ltd, Zhengzhou 450001, China

To establish HPLC fingerprints offrom different producing areas, in order to provide reference and basis for the construction of quality evaluation system and the exploration of potential quality markers ofcombined with chemometrics.The extraction and detection methods offrom Henan, Shandong and Hebei were optimized, and the optimal HPLC fingerprint conditions were established. Chromatographic column: symmetry C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase: acetonitrile (a)-0.2% formic acid aqueous solution (b); gradient elution conditions; injection volume: 10 μL; detection wavelength: 245 nm; flow rate: 0.5%. The column temperature was 38oC . HPLC fingerprint similarity evaluation system (2012.130723) was used to determine common peaks and evaluate similarity. Cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis were performed by SIMCA-P 14.1 software.The HPLC fingerprints offrom three regions matched 45 common peaks and 16 peaks were identified. The results of HCA and PCA can completely distinguish the samples from Shandong and Hebei provinces. The results of OPLS-DA showed that the samples from Henan Province contained the most isochlorogenic acid B, cumalic acid, morroniside; troxerutin, neochlorogenic acid and secoxyloganin; The samples from Shandong Province contained the most chlorogenic acid, isochlorogenic acid C and cynaroside; the samples from Hebei Province contained the most xylostein.The HPLC fingerprint ofcombined with chemometrics can be applied to the research and development of the quality standard ofand the exploration of its potential Q-Markers and daodi factors .

; fingerprint; PCA; OPLS-DA; isochlorogenic acid B; cumalic acid; morroniside; troxerutin; neochlorogenic acid; secoxyloganin; cynaroside

R286.2

A

0253 - 2670(2022)15 - 4833 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.027

2021-12-03

国家自然科学基金资助项目（81603232）；河南中医药大学博士科研基金资助项目（BSJJ2015-13）

刘天亮，在读硕士，专业方向为中药材规范化种植、中药资源与质量评价。E-mail: 974809832@qq.com

通信作者：杨林林，讲师，从事于主要从事药用植物栽培生理与生态学研究。Tel: 13180883352 E-mail: yangll-hatcm@hactcm.edu.cn

董诚明，教授，主要从事药用植物学、中药资源学研究。Tel/Fax: (0371)86535313 E-mail: dcm663@sina.com

[责任编辑 时圣明]