反式西红花酸-环糊精包合物的制备、表征、安全性和抗肿瘤评价

刘雪城，丁平刚，金皓洁，何凌云*，刘陶世*

反式西红花酸-环糊精包合物的制备、表征、安全性和抗肿瘤评价

刘雪城1, 2，丁平刚1，金皓洁2，何凌云2*，刘陶世1*

1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2. 南京艾德凯腾生物医药有限责任公司，江苏 南京 211100

制备难溶性药物反式西红花酸（-crocetin，TC）与甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）的包合物（TC-MβCD），并评价包合物对TC溶解度、安全性和有效性的影响。采用单因素实验和Box-Behnken响应面法筛选环糊精种类等工艺参数，采用冷冻干燥法制备TC-MβCD。采用扫描电子显微镜（SEM）、UV法、体外释放度测定法等对TC-MβCD包合物进行表征，采用HPLC法测定TC含量。采用Caco-2细胞模型研究TC与TC-MβCD的体外转运机制。采用斑马鱼鱼卵/胚胎发育保护模型评价TC-MβCD包合物的安全性，采用体外乳腺癌4T1细胞和裸鼠体内乳腺癌MCF-7肿瘤模型对比研究TC及TC-MβCD的体内外抗肿瘤活性。在5种环糊精中，MβCD对TC的增溶效果最好，优化包合工艺参数为料液比33%，搅拌温度60 ℃，搅拌时间120 min。TC-MβCD冻干粉中TC含量2.2%，增溶效果显著，复溶性良好。SEM和UV法表明TC被MβCD的空穴结构包合，TC-MβCD冻干粉可在0.1%聚山梨酯80-pH 6.8介质中释放，其拟合曲线符合一级释药模型。Caco-2细胞模型表明TC转运机制为被动扩散，包合促进吸收。斑马鱼鱼卵/胚胎发育试验发现，TC-MβCD包合物对斑马鱼的孵化率、斑马鱼胚胎的存活率和心率几乎没有影响，表明包合物安全性好。乳腺癌4T1细胞体外抗肿瘤表明TC-MβCD的IC50明显低于TC，说明包合物对乳腺癌细胞有更强的抑制作用。裸鼠体内MCF-7肿瘤模型表明，相同药物剂量下，TC-MβCD的抑制率为33.71%，远高于TC的16.86%。采用相溶解度法筛选出合适的环糊精，通过冷冻干燥制备TC-MβCD冻干粉，并对其进行评价。TC被MβCD包合后，显著增加了TC的溶解度，提高了TC的抗肿瘤活性和安全性，为TC包合物制剂工业化生产提出理论依据。

反式西红花酸；甲基-β-环糊精；包合物；表征；药物释放；抗肿瘤

反式西红花酸（-crocetin，TC）是西红花与栀子等中的主要活性成分之一，具有抗癌、改善溃疡结肠炎、神经保护和保肝护脏等药理活性[1-3]。但其几乎不溶于水、乙醇、甲醇、醋酸乙酯，易溶于碱溶液，口服吸收差，易氧化不稳定，极大地限制了其药理效应的发挥[4-7]。为提高TC的水溶性、稳定性和药效，国外先后将西红花酸制成聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］纳米粒、脂质体、微囊和树枝状大分子等新型给药系统，但效果不太理想[8-12]。环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖以及其半合成衍生物的总称。环糊精在食品和药品行业有着广泛应用，在药物制剂中环糊精常作为药物载体用于提高药物溶解度、提高药物稳定性、矫味、缓释和靶向作用等[13-14]，常用的环糊精主要有α-环糊精、γ-环糊精、β-环糊精及其衍生物。不同环糊精因结构差异使得其包合性能有所不同。采用环糊精包合技术拟提高TC的水溶性、稳定性和药效是值得探索的方法，本实验对TC环糊精包合物的制备工艺、质量表征、体外释药、吸收机制、安全性和抗肿瘤药理活性进行较系统的研究，为后续TC与甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）的包合物TC-MβCD的新药研发打下基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪，SPD检测器，日本岛津仪器公司；XP型分析天平（＝0.01 mg）、S220-K pH计，梅特勒托利多公司；UV-2450PC型紫外/可见分光光度计，日本岛津仪器公司；ZNCL- GS型磁力搅拌器，南京文尔仪器设备有限公司；LY0-0.5型真空冷冻干燥机，上海东富龙科技有限公司；FEI PHENO型扫描电子显微镜（SEM），日本电子株式会社；Thermo HERA cell 150i CO2细胞培养箱，美国Thermo公司；Millicell-ERS型细胞电阻仪，美国Millipore公司；Transwell培养板，美国Corning公司；BCM-1000A型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；Vision G2 Elite 8型智能溶出仪，美国Hanson公司；MD34透析袋（截留相对分子质量1000），美国Viskase公司；Nikon TS100型倒置显微镜，日本尼康公司；Zeiss Axio Vert. A1型荧光显微镜，德国Carl Zeiss AG；MK3&4MK2酶标仪，美国Bio Tek公司。

1.2 材料

TC对照品，批号wkq16041207，四川省维克奇生物科技有限公司，HPLC测定质量分数≥99%；TC原料药，批号190106，济南浩化实业有限责任公司，质量分数＞98%；甲醇，Honeywell公司，色谱纯；α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、MβCD、羟丙基-β-环糊精，山东滨州智源生物科技有限公司；DMEM培养基，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Hyclone公司；小鼠乳腺癌4T1细胞（American type culture collection，ATCC）、人乳腺癌细胞系MCF-7（中国科学院细胞库）；CCK-8试剂盒（Bioworld公司）；Caco-2细胞株（American type culture collection，ATCC）；EdU细胞增殖检测试剂盒（R11053.9），广州锐博生物技术有限公司；水为高纯水，其他化学试剂均为分析纯。

实验用斑马鱼，4月龄野生型AB斑马鱼，购买于南京一树梨花公司。雄性裸鼠，SPF级，体质量（22±2）g，购买于江苏凯基生物技术股份有限公司，所有动物实验遵循南京中医药大学伦理委员会有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。

2 方法与结果

2.1 TCHPLC测定方法学的建立

2.1.1 色谱条件[15]LC-20A岛津高效液相色谱仪，色谱柱Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水-冰醋酸（75.0∶24.5∶0.5），检测波长423 nm，柱温35 ℃，体积流量1 mL/min；进样量20 μL。色谱图见图1。

图1 TC对照品(A)和TC-MβCD包合物(B) 的HPLC图

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取TC-MβCD冻干粉10 mg，置20 mL量瓶中，加流动相稀释，超声破化包合结构，使其充分溶解，冷却至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀。

2.1.3 线性范围考察 精密称取5.01 mg TC对照品至100 mL量瓶中，加吡啶5.0 mL溶解，流动相稀释至刻度，即得50.1 μg/mL的对照品储备液，精密量取储备液0.1、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mL于50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度。即得含TC 0.100 2、0.501、1.002、4.008、8.013、12.024、16.032、20.04 μg/mL的系列对照品溶液。以峰面积（）为响应值对TC的质量浓度作图，绘制标准曲线，得回归方程为＝12 704 1＋11 760，2＝0.999 8，表明TC在0.100 2～20.04 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 取12.024 μg/mL对照品溶液，连续重复进样6次，每次20 μL，峰面积的RSD为0.39%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 按“2.1.2”项下方法制备包合物供试品溶液，取12.024 μg/mL TC对照品溶液和TC包合物供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h进行测定，前者RSD为0.47%，后者RSD为1.44%，结果表明10 h内对照品溶液和供试品溶液稳定。

2.1.6 重复性试验 按照“2.1.2”项下方法制备包合物供试品溶液6份，包合物中TC的平均质量分数为2.25%，RSD为0.77%，结果表明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 取9份TC-MβCD包合物，精密称定，分别按样品中TC含量添加TC对照品适量（80%、100%、120%各3份），测得TC平均加样回收率为96.37%，RSD为2.15%，结果表明该方法回收率良好。

2.1.8 样品测定 取各实验项下样品，制备成供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件检测各个样品中TC含量。

2.2 相溶解度法研究环糊精对TC的增溶作用

2.2.1 环糊精种类、用量和温度对TC的增溶试验 分别精密称定α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、MβCD、羟丙基-β-环糊精，用蒸馏水分别配制成浓度分别为2、4、6、8、10 mmol/L的溶液。加入过量TC于上述溶液中，分别在15、37、60 ℃避光条件下置于电热恒温震荡水槽（转速为200 r/min）振摇48 h，溶解平衡后，微孔滤膜滤过（0.45 μm），测定滤液中TC的含量。表1结果表明，当不添加环糊精时，TC在水中的溶解度很小，仅有0.72 μg/mL，当添加环糊精后，TC在水中的溶解度增大，其增溶效果与环糊精种类、用量和温度有关。环糊精浓度越大、温度越高、增溶效果越好。但是只有MβCD对TC的增溶效果显著，其他4种环糊精增溶效果不理想。

2.2.2 MβCD对TC的包合常数（） 包合物的形成过程是主客体相互选择性识别的动态平衡过程，而值大小能够反映出环糊精和药物形成包合物过程中结合力的强弱[5]。一般值越大说明包合效果越好。通过包合物的相溶解度曲线得出其线性方程，再计算。

＝/[0(1－)]

为相溶解度曲线的斜率，0为TC在各温度下水中的饱和溶解度

表2结果表明，随着温度的升高，MβCD对TC的逐渐增大，说明升高温度包合效果越好。MβCD在不同温度下，与TC包合的吉布斯自由能变化（Δ）＜0，表明MβCD与TC的包合自发进行，根据热力学第2定律，疏水作用在包合中起主要作用。

表1 不同温度条件下环糊精种类和用量对TC增溶效果的比较(, n = 3)

Table 1 Comparison of cyclodextrin types and amounts on solubilization of TC at different temperatures (, n = 3)

表1 不同温度条件下环糊精种类和用量对TC增溶效果的比较(, n = 3)

温度/℃环糊精种类溶解度/(μg∙mL−1) 2 mmol∙L−14 mmol∙L−16 mmol∙L−18 mmol∙L−110 mmol∙L−1 15α-环糊精0.73±0.521.19±0.271.13±0.861.37±0.751.42±0.68 β-环糊精0.65±0.290.83±0.500.89±0.571.05±0.541.27±0.80 γ-环糊精0.46±0.320.48±0.310.53±0.170.69±0.430.81±0.34 MβCD1.42±0.343.34±0.486.32±0.638.25±0.6510.55±0.85 羟丙基-β-环糊精0.79±0.401.15±0.391.73±0.482.48±0.542.53±0.65 37α-环糊精0.95±0.451.21±0.371.32±0.821.40±0.681.60±0.45 β-环糊精0.69±0.291.00±0.370.99±0.701.37±0.431.49±0.85 γ-环糊精0.38±0.110.55±0.260.51±0.150.97±0.150.87±0.26 MβCD1.52±0.293.30±0.496.29±0.609.09±0.6311.27±0.85 羟丙基-β-环糊精0.92±0.311.43±0.402.04±0.452.75±0.482.96±0.59 60α-环糊精1.48±0.681.94±0.482.25±0.762.70±0.712.89±0.37 β-环糊精1.14±0.231.68±0.292.31±0.602.61±0.432.80±0.80 γ-环糊精1.11±0.891.32±0.371.31±0.591.72±0.461.91±0.32 MβCD1.90±0.383.72±0.436.41±0.599.32±0.7112.44±0.87 羟丙基-β-环糊精1.14±0.881.91±0.372.29±0.463.16±0.603.62±0.51

表2 MβCD对TC的K值

2.3 TC-MβCD包合物的制备

将MβCD在一定温度下配成一定浓度的溶液，称取一定量的TC置于溶液中，在恒温磁力搅拌器上搅拌（转速1000 r/min）一定时间，冷冻干燥，即得TC-MβCD包合物。

2.3.1 单因素实验考察环糊精用量和搅拌条件对TC-MβCD包合率的影响 以不同MβCD质量分数（0、10%、30%、50%、70%）、不同搅拌时间（30、60、90、120、150 min）、不同搅拌温度（40、50、60、70、80 ℃）以及不同搅拌速率（200、500、1000、1500 r/min）为考察因素，包合率为评价指标，考察各单因素对TC-MβCD包合率的影响，结果不同MβCD质量分数时TC-MβCD的包合率分别为0、（38.6±3.3）%、（78.4±3.8）%、（85.6±4.3）%、（86.2±3.7）%（＝3），不同搅拌时间时TC-MβCD的包合率分别为（32.6±4.2）%、（57.3±2.3）%、（78.6±3.4）%、（81.7±2.3）%、（74.3±3.6）% （＝3），不同搅拌温度时TC-MβCD的包合率分别为（56.4±1.2）%、（78.6±2.0）%、（82.2±1.7）%、（82.6±1.9）%、（83.0±1.5）%（＝3），不同搅拌速率时TC-MβCD的包合率分别为（73.6±1.4）%、（76.9±1.9）%、（77.4±1.8）%、（78.6±2.0）%、（78.3±1.6）%（＝3）。结果表明，MβCD用量越大，温度越高，包合率越高，但温度大于60 ℃后包合率增加不明显。包合率随着搅拌时间延长相应提高，但大于150 min后包合率反而下降。搅拌转速对包合率的影响不显著。

2.3.2 采用Box-Behnken响应面法优化包合工艺参数 选取影响包合效果较大的MβCD质量分数（1）、搅拌温度（2）和搅拌时间（3）3个因素，设置3个水平对15个试验点[16]。结果见表3。

使用Design-Expert 8.0.6软件对上表数据进行2次多项式回归拟合，该实验的2项式拟合方程为包合率＝−133.125－0.1721＋4.9462＋1.3013＋0.011 812＋2.250×10−313－2.500×10−323－0.012 912－0.043 222－5.018×10−332，该方程表明影响包合率的因素主次顺序为搅拌温度＞搅拌时间＞料液比。

表3 处方工艺的Box-Behnken响应面法实验设计与结果

图2和表4结果表明，模型优化后给出的最佳参数为料液比33.74%、搅拌温度58.41 ℃、搅拌时间127.12 min、包合率为86.614%。结合大生产对工艺参数进行修正，得到TC-MβCD 包合工艺料液比33%，搅拌温度60 ℃，搅拌时间120 min。

采用以上包合工艺制备3批样品进行验证，其包封率分别为86.4%、85.7%、87.0%，结果表明，该工艺重复性良好，根据星点设计实验所建立的数学模型预测性良好。

2.4 TC-MβCD包合物的表征

利用紫外-可见分光光度计检测原料药的吸收峰与包合的吸收峰之间的差异[13,18]。图3表明，TC包合后其在400～500 nm的吸收峰消失。

加强PPP投资型项目安全管理，预防安全事故发生，这是提升项目建设效益的重要保障。但调查显示，部分参与单位将工作重心放在如何提高项目质量方面，对安全管理不重视，没有根据项目安全管理需要，制定健全的安全管理制度。再加上在项目运行中忽视加强安全管理，不注重预防安全事故，最终导致不必要损失发生，降低项目建设效益。

图2 X1、X2、X3对包合率影响的3D曲面图和等高线图

表4 方差分析结果

图3 TC (A)、TC和MβCD物理混合物(B) 与TC-MβCD包合物(C) 的紫外吸收光谱图

利用SEM观察TC原料药及包合物的形态[17]，图4结果表明TC呈微小颗粒结晶形状，MβCD呈原弧片状形片状，而包合物不同于主客体的形貌，大小和形状呈现了不规则的块状形貌，以上表明主客体之间形成了包合物，结构性质发生改变。

2.5 TC-MβCD的体外释放[19-20]

精密称取一定量的TC原料药和等药量的TC- MβCD包合物，用0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8的水溶液混悬后放入截留相对分子质量1000的透析袋内，两端用透析夹夹紧保证不渗漏，分别置于以900 mL 0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8的水溶液为介质的溶出杯中，将其置于智能溶出仪中，设置温度（37.0±0.1）℃，转速75 r/min，进行体外释放，取样点分别为10、15、30、45、60、90 min及2、3、4、6、8、10、12、18 h。每次取样10 mL，同时补加相同温度的等量介质溶液。样品溶液用0.45 μm针筒滤头过滤后，进样测定TC的质量浓度，计算累积释放率。TC原料药因为在释放介质中溶解度太低，HPLC难以检测，未绘制出释药曲线。TC-MβCD包合物的药物释放曲线结果见图5。表5结果表明，TC从包合物中的释放符合一级速率释药，具有缓释效果。

图4 TC (A)、MβCD (B)、TC-MβCD包合物(C)的SEM图

图5 TC-MβCD包合物在0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8介质中药物释放曲线(, n = 3)

表5 TC-MβCD包合物在介质中药物释放拟合方程

2.6 Caco-2细胞模型研究TC与TC-MβCD包合物的体外转运机制[21-22]

Caco-2细胞培养21 d后，取跨膜电阻大于600 Ω/cm2的Transwell培养板，首先，将细胞单层用预热（37 ℃）的空白汉克平衡盐溶液（HBSS）洗涤3次，在Apical侧（AP）到Basolatera侧（BL）的转运试验中，将等浓度的TC溶液与TC-MβCD包合物溶液加0.5 mL到AP面作为供给池，将1.5 mL HBSS（pH 7.4）添加到BL中作为接收池。在BL到AP转运试验中，将等浓度的TC溶液或TC- MβCD包合物溶液分别加1.5 mL到BL中，并将0.5 mL HBSS添加到AP中。每个实验组设置3个平行孔。置37 ℃培养箱中培养，分别在120 min时吸取接收池溶液各200 μL进行HPLC测定。结果见表6。TC的app（AP→BL）值与app（BL→AP）值与相差不大（＞0.05），说明TC跨越肠上皮细胞的可能主要转运途径为被动扩散。但TC的app（AP→BL）值与app（BL→AP）值与TC-MβCD包合物有显著性差异 （＜0.05），说明包合促进了TC的吸收，从TC和TC-MβCD包合物的app（BL→AP）/app（AP→BL）值均小于1.5可以看出TC可能不存在外排转运机制。TC并非通过胞旁转运及载体介导的转运，而是主要通过被动的跨细胞扩散而渗透[2]。

表6 制剂对TC (20 μmol∙L−1) 在Caco-2细胞转运的影响

2.7 TC-MβCD包合物对斑马鱼鱼卵/胚胎发育的安全性

选取健康的5 hpf的鱼卵均匀的分到24孔板中，每孔20枚鱼卵。将用E3溶液配制好的含TC不同质量浓度（10、50、100、150、200 μg/mL）的TC-MβCD包合物溶液分别加入到相应的孔中，每孔加入3 mL溶液，每个浓度设置2个复孔。每孔的鱼卵作为1个统计数据。分别于24、48、72、96 hpf观察胚胎的发育情况，并统计24、48、72、96 hpf的胚胎累积死亡率、畸形率、孵化率以及72、96 hpf的心率、体长等。心率的检测方式：在Leica DMi8显微镜4倍视野下计算斑马鱼幼虫心脏1 min完成搏动的次数。体长的计算方法：在Leica DMi8显微镜4倍视野下测量斑马鱼幼虫眼睛中心到尾巴末端的直线距离。结果见图6和表7，结果表明TC-MβCD包合物中TC不同质量浓度（10、50、100、150、200 µg/mL）持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的存活率均在90.0%及以上。将所得存活率的数据进行统计学分析，发现与对照组相比，不同质量浓度下TC-MβCD包合物孵育后的斑马鱼鱼卵/幼虫的存活率均无显著性差异。

图6 在24、48、72、96 hpf时间点的斑马鱼的代表性光学图像(, n = 3)

表7 TC-MβCD包合物不同质量浓度持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的存活率(, n = 3)

Table 7 Survival rate of zebra fish eggs/larvae incubated continuously at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表7 TC-MβCD包合物不同质量浓度持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的存活率(, n = 3)

孵育时间/hpf存活率/% 对照10 μg∙mL−150 μg∙mL−1100 μg∙mL−1150 μg∙mL−1200 μg∙mL−1 2495.66±4.3595.50±5.0895.69±4.1098.07±3.6295.82±4.3594.37±5.31 4896.62±3.8795.98±4.1295.82±3.6298.55±3.8796.30±3.8793.89±4.83 7295.50±3.6494.69±4.5895.98±3.8697.75±5.3195.82±5.0793.73±4.38 9695.98±4.3495.66±4.3596.46±3.4898.55±5.0795.50±4.1293.73±4.83

由表8可知，TC-MβCD包合物不同质量浓度（10、50、100、150、200 µg/mL）持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的累积孵化率最低值均出现在200 µg/mL的质量浓度下，其72、96 hpf的孵化率平均孵化率为86.70%和85.08%。将所得孵化率的数据进行统计学分析，发现与对照组相比，不同质量浓度下TC-MβCD包合物孵育后的斑马鱼鱼卵/幼虫的孵化率无显著性差异。

表9结果表明，将所得心率的数据进行统计学分析，发现与对照组相比，不同质量浓度下TC- MβCD包合物孵育后的斑马鱼鱼卵/幼虫的心率无显著性差异。

表8 TC-MβCD包合物不同质量浓度持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的孵化率(, n = 3)

Table 8 Hatchability of zebra fish eggs/larvae incubated continuously at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表8 TC-MβCD包合物不同质量浓度持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的孵化率(, n = 3)

孵育时间/hpf孵化率/% 对照10 μg∙mL−150 μg∙mL−1100 μg∙mL−1150 μg∙mL−1200 μg∙mL−1 7293.98±2.1292.75±1.6393.08±1.6896.30±3.5096.14±4.4586.70±1.87 9694.14±2.0992.59±2.5892.59±1.3994.91±4.4295.99±3.4785.08±0.53

表9 TC-MβCD包合物不同质量浓度持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的心率(, n = 3)

Table 9 Heart rate of zebra fish eggs/larvae continuously incubated at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表9 TC-MβCD包合物不同质量浓度持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的心率(, n = 3)

组别质量浓度/(μg∙mL−1)心率/(次∙min−1) 对照−166.54±17.89 TC-MβCD包合物10176.70±14.13 50175.96±9.36 100181.91±14.54 150173.23±11.90 200174.72±23.83

2.8 CCK8法测定TC与TC-MβCD包合物的体外抗肿瘤活性

用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、饱和湿度、含5% CO2的培养箱中培养4T1细胞。取对数生长期、生长状态良好的4T1细胞（乳腺癌细胞），用0.25%胰酶消化后细胞计数。将4T1细胞接种到96孔板中，每孔7000个细胞。经过预实验确定加入的TC原料药的浓度为0、50、100、200、300、400、500 μmol/L和TC-MβCD包合物制剂浓度为（以TC计）0、25、50、100、200、300、400 μmol/L，以未处理的细胞为对照。第2天，根据药物浓度的不同将细胞分成12组，更换含有相应浓度药物的培养基，继续培养。每种浓度6个重复进行测试。处理48 h后进行CCK8检测，即各组细胞在检测时间点时，每孔加10 μL CCK8溶液，继续在37 ℃、5% CO2培养箱中培养3 h。选择450 nm波长，在酶标仪法上测定各孔吸光度（）值，记录结果。利用GraphPad Prism软件的Dose-response- inhibition算法计算得出药物对细胞的半数致死浓度（IC50），结果见图7。结果表明，TC原料药随着浓度增大其乳腺癌细胞存活率下降，且呈明显的浓度依赖性。在低浓度时（≤200 μmol/L）包合物与原料药相比细胞存活率相差不大。在高浓度时（≥200 μmol/L）细胞存活率包合物均小于原料药。经GraphPad Prism软件计算，原料药对4T1细胞的IC50＝356.0 μmol/L，包合物制剂对4T1细胞的 IC50＝283.5 μmol/L，说明TC包合物比TC原料药对乳腺癌细胞有更强的抑制作用。

图7 TC与TC-MβCD包合物不同浓度下的细胞毒性试验(, n = 6)

2.9 裸鼠体内MCF-7肿瘤模型研究TC与TC- MβCD包合物的体内抗肿瘤活性

2.9.1 动物分组与模型的建立 实验前将雄性裸鼠（22±2）g保持在无病原体的条件下，正常进食饮水1周后，将对数生长期的0.1 mL MCF-7细胞悬液（1×107细胞/mL）接种到雄性裸鼠的右腋皮下，建立肿瘤模型。当平均肿瘤模型体积达到60 mm3时，将小鼠随机分为3组（＝6）：对照组、TC组、TC-MβCD组。

2.9.2 给药与治疗 对照组、TC组和TC-MβCD包合物组分别以0.9%盐溶液，游离的TC（含50 mg/kg TC的0.5%羟丙基甲基纤维素溶液）和TC-MβCD包合物（相当于50 mg/kg的TC）剂量ig从第1天到第12天，每天1次。肿瘤体积用游标卡尺测量，并在第1、3、5、7、9、11、13天测量小鼠的肿瘤体积。并进行统计学分析。在实验结束时，对动物实施安乐死并剥离肿瘤，统计分析肿瘤体积，计算肿瘤体积抑制率。然后对肿瘤进行苏木精和曙红（HE）染色以评估病理变化。

2.9.3 结果 图8结果表明，TC和TC-MβCD包合物均对肿瘤表现出治疗作用，并在给药后，伴随着肿瘤坏死。与TC治疗相比，TC-MβCD包合物治疗后肿瘤的HE染色显示细胞间间隙增大，组织坏死增加。治疗2周的体积-时间曲线如图9所示。与对照组相比，两者相同剂量的TC和TC-MβCD包合物，TC-MβCD包合物的抑制率为33.71%，远高于TC（16.86%），TC-MβCD包合物增强了TC的抗肿瘤作用（＜0.05）。

图8 HE染色观测抗肿瘤活性

与TC组比较：*P＜0.05

3 讨论

本研究比较了α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、MβCD、羟丙基-β-环糊精对TC的增溶效果，发现只有MβCD对TC的增溶效果显著，其他4种环糊精增溶效果一般。环糊精包合方法有饱和水溶液法、超声法、研磨法、冷冻干燥法、喷雾干燥法等，考虑到TC-MβCD的易溶于水和热稳定性，选择冷冻干燥法制备TC-MβCD；单因素实验发现MβCD用量越大，包合温度越高，包合时间越长，TC的包合率越高，但温度大于60 ℃后包合率增加不明显，包合时间大于150 min后包合率反而下降，此外发现搅拌转速对包合率的影响不显著；采用Box- Behnken响应面法优选出最佳包合条件为料液比33%，搅拌温度60 ℃，搅拌时间120 min。

本实验采用SEM和紫外光谱验证了TC-MβCD包合物的形成，采用Caco-2细胞模型研究了TC与TC-MβCD的体外转运机制，发现包合物能促进TC的吸收。体外释放度研究表明，TC包合物显著提高了TC的溶解度并具有一定的缓释作用，释药模型呈一级释放模型。环糊精包合物中药物在消化道的释药除了与包合物中药物的扩散渗漏有关外，还受消化酶和大肠菌群对环糊精的降解和消化道其它成分的置换等因素影响，但目前的释放介质难以复制这些因素，后续将进一步开展TC-MβCD的结构和药动学系统性研究以阐明环糊精包合对TC生物利用度的影响。

裸鼠体内MCF-7肿瘤模型试验发现，与TC原料药相比，TC包合物的体内抗肿瘤药理活性明显增强，这可能是由于环糊精包合物的增溶和缓释作用，提高了TC的生物利用度所致。由于CCK-8检测非常方便快捷，且CCK-8对细胞的毒性很小，检测灵敏度高且重复性好，故体外抗肿瘤选用CCK8检测。体外乳腺癌4T1细胞模型试验表明TC包合物比TC原料药对乳腺癌细胞有更强的抑制作用。采用斑马鱼鱼卵/胚胎发育试验发现，TC-MβCD包合物对斑马鱼的孵化率、斑马鱼胚胎的存活和心率几乎没有影响，表明包合物安全性好。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] Colapietro A, Mancini A, D'Alessandro A M,. Crocetin and crocin from saffron in cancer chemotherapy and chemoprevention [J]., 2019, 19(1): 38-47.

[2] Giaccio M. Crocetin from saffron: An active component of an ancient spice [J]., 2004, 44(3): 155-172.

[3] Nam K N, Park Y M, Jung H J,. Anti-inflammatory effects of crocin and crocetin in rat brain microglial cells [J]., 2010, 648(1): 110-116.

[4] Lautenschläger M, Sendker J, Hüwel S,. Intestinal formation of-crocetin from saffron extract (L.) andpermeation through intestinal and blood brain barrier [J]., 2015, 22(1): 36-44.

[5] Gezici S. Comparative anticancer activity analysis of saffron extracts and a principle component, crocetin for prevention and treatment of human malignancies [J]., 2019, 56(12): 5435-5443.

[6] Mizuma H, Tanaka M, Nozaki S,. Daily oral administration of crocetin attenuates physical fatigue in human subjects [J]., 2009, 29(3): 145-150.

[7] Umigai N, Murakami K, Ulit M V,. The pharmacokinetic profile of crocetin in healthy adult human volunteers after a single oral administration [J]., 2011, 18(7): 575-578.

[8] Zhou H, Yuan X F, Zhao Q S,. Determination of oxygen transmission barrier of microcapsule wall by crocetin deterioration kinetics [J]., 2013, 237(4): 639-646.

[9] Sadat Tabatabaei Mirakabad F, Nejati-Koshki K, Akbarzadeh A,. PLGA-based nanoparticles as cancer drug delivery systems [J]., 2014, 15(2): 517-535.

[10] Esposito E, Drechsler M, Mariani P,. Nanostructured lipid dispersions for topical administration of crocin, a potent antioxidant from saffron (L.) [J].-, 2017, 71: 669-677.

[11] Soltani F, Ramezani M, Amel Farzad S,. Comparison study of the effect of alkyl-modified and unmodified PAMAM and PPI dendrimers on solubility and antitumor activity of crocetin [J]., 2017, 45(7): 1356-1362.

[12] Hafezi Ghahestani Z, Alebooye Langroodi F, Mokhtarzadeh A,. Evaluation of anti-cancer activity of PLGA nanoparticles containing crocetin [J]., 2017, 45(5): 955-960.

[13] 任敏, 孙希阳, 贺丰洋, 等. β-环糊精包合物的研究进展 [J]. 山东化工, 2020, 49(18): 77-78.

[14] Aloisio C, Gomes de Oliveira A, Longhi M. Characterization, inclusion mode, phase-solubility andrelease studies of inclusion binary complexes with cyclodextrins and meglumine using sulfamerazine as model drug [J]., 2014, 40(7): 919-928.

[15] 刘同征, 钱之玉. 西红花酸含量的高效液相色谱法测定 [J]. 药物分析杂志, 2002, 22(3): 217-218.

[16] 李曦, 陈晨, 欧洁睿, 等. 星点设计-效应面法优化降香油-羟丙基-β-环糊精包合物的制备工艺 [J]. 中国药学杂志, 2016, 51(2): 120-126.

[17] 姜兴粲, 李冰, 张继瑜. 环糊精包合物超分子体系的制备与表征研究进展 [J]. 动物医学进展, 2021, 42(3): 96-101.

[18] 李宁, 王雪婷, 蒋少鸿, 等. 姜黄素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备及其体外抗肿瘤活性评价 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2018, 24(19): 31-36.

[19] Rahaiee S, Hashemi M, Shojaosadati S A,. Nanoparticles based on crocin loaded chitosan-alginate biopolymers: Antioxidant activities, bioavailability and anticancer properties [J]., 2017, 99: 401-408.

[20] Nair A B, Attimarad M, Al-Dhubiab B E,. Enhanced oral bioavailability of acyclovir by inclusion complex using hydroxypropyl-β-cyclodextrin [J]., 2014, 21(7): 540-547.

[21] 慈小燕, 武卫党, 李亚卓, 等. 不同BCS分类药物的肠道渗透性研究 [J]. 中国新药杂志, 2018, 27(1): 63-68.

[22] 陈彦, 王晋艳, 辛然, 等. 柴胡皂苷对芍药苷在Caco-2细胞模型中吸收转运的影响 [J]. 中国中药杂志, 2012, 37(12): 1850-1854.

Preparation, characterization, safety and antitumor evaluation of-crocetin cyclodextrin inclusion complex

LIU Xue-cheng1, 2, DING Ping-gang1, JIN Hao-jie2, HE Ling-yun2, LIU Tao-shi1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Nanjing CoreTech Biomedical Co., Ltd., Nanjing 211100, China

To prepare insoluble drugs-crocetin (TC) and methyl-β-cyclodextrin (MβCD) inclusion complex (TC-MβCD), and evaluate the effect of inclusion complex on the solubility, safety and effectiveness of TC.The kinds of cyclodextrins and other process parameters were selected by single factor test and Box-Behnken response surface method, and TC-MβCD was prepared by freeze-drying method. The inclusion complex of TC-MβCD was characterized by scanning electron microscope, UV method andrelease assay, and the content of TC was determined by HPLC. Caco-2 cell model was used to study the transport mechanism of TC and TC-MβCD. The safety of TC-MβCD inclusion complex was evaluated by using zebrafish egg/embryo development protection model. The anti-tumor activity of TC and TC-MβCDandwas compared by using 4T1 breast cancer cell anti-tumor modeland MCF-7 tumor model in nude mice.Among the five cyclodextrins, MβCD had the best solubilization effect on TC. The optimized inclusion process parameters were as follows: solid-liquid ratio 33%, stirring temperature 60 ℃, stirring time 120 min. The content of TC in TC-MβCD lyophilized powder was 2.2%, which had remarkable solubilization effect and good resolubility. Scanning electron microscopy and UV method showed that TC was encapsulated by the hole structure of MβCD, and TC-MβCD lyophilized powder could be released in the range of 0.1% Tween80-pH 6.8, The fitting curve accorded with the first-order drug release model. Caco-2 cell model showed that the transport mechanism of TC was passive diffusion, and inclusion promoted absorption. Zebrafish egg/embryo development test found that TC-MβCD inclusion complex had little effect on zebrafish hatching rate, zebrafish embryo survival rate and heart rate, indicating that the inclusion complex was safe. The anti-tumor activity of 4T1 cellsshowed that the IC50of TC-MβCD was significantly lower than that of TC, indicating that the inclusion compound had a stronger inhibitory effect on breast cancer cells. The MCF-7 tumor model in nude mice showed that under the same drug dose, the inhibition rate of TC MβCD was 33.71%, much higher than 16.86% of TC.Appropriate cyclodextrins were screened out by phase solubility method, and TC-MβCD lyophilized powder was prepared by freeze-drying and evaluated. The inclusion of TC by MβCD significantly increases the solubility of TC, improves the antitumor activity and safety of TC, and provides a theoretical basis for the industrial production of TC inclusion complex preparations.

-crocetin; methyl-β-cyclodextrin; inclusion complex; characterization; drug release; antitumor

R283.6

A

0253 - 2670(2022)15 - 4663 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.009

2022-01-19

国家自然科学基金青年基金项目（81403114）

刘雪城，硕士研究生，从事中药制药技术与开发研究。Tel: 15738510895 E-mail: liuxuecheng0924@126.com

通信作者：何凌云，博士，硕士生导师，从事中药制药技术与开发研究。Tel: 13057657678 E-mail: helina@core-tech.com.cn

刘陶世，博士，硕士生导师，副研究员，从事中药药剂学研究。Tel: 13611504994 E-mail: tsliur4111@sina.com

[责任编辑 郑礼胜]