基于标准汤剂的罗布麻叶配方颗粒质量标准研究

何民友，李振雨，王利伟，段志文，杨洁，叶瑞平，陈向东

广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻L.的干燥叶，以“泽漆”之名始载于《救荒本草》，《本草纲目拾遗》言其“利消痰如神”。现代药理研究表明，罗布麻叶具有降血压、降血脂、抗糖尿病血管病变、抗氧化、保肝、抗抑郁、利尿等多种生物活性。罗布麻是一种抗逆性极强的宿根性多年生直立半灌木，多野生在盐碱、荒漠地区，在我国主要分布于新疆、甘肃、青海、内蒙古、江苏、陕西、山东、安徽、宁夏、山西、河北、河南、辽宁等。罗布麻叶中主要含黄酮类、有机酸类、鞣质、甾体类等化学成分，黄酮类化合物为其主要活性成分，具有抗抑郁、抗氧化、降血压、降血脂、保肝等作用。

中药饮片标准汤剂是根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（以下简称《技术要求》）中“研究表征标准汤剂用汤剂的制备”项的指导原则，参考中药药性及入药部位的分类，并参照《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号）制备而成的中药饮片水煎剂。中药配方颗粒是传统中药饮片的改良产品，是中药现代化的有益尝试，具有安全卫生、携带方便、便于调剂、质量保证等优点。中药配方颗粒的药学研究报告工艺参数确定、质量控制方法和指标选择、限度制定，均须与标准汤剂进行对比，以保证质量一致性。为更好评价罗布麻叶配方颗粒的质量，本研究选用19批主产区罗布麻叶药材，按2018年版《上海市中药饮片炮制规范》炮制后制备标准汤剂，以出膏率、金丝桃苷和异槲皮苷的含量及转移率、指纹图谱为参照，对罗布麻叶配方颗粒的质量进行评价，为罗布麻叶配方颗粒质量标准的制定提供依据。

1 仪器与试药

H-Class 超高效液相色谱仪，美国沃特世有限公司；Vanquish 超高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ME204E万分之一天平、XP26百万分之一天平，梅特勒-托利多公司；HWS28恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；KQ500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q Direct超纯水系统，默克股份有限公司。

19批罗布麻叶药材，来自6个省份，由广东一方制药有限公司采购管理部人员于产地采收，经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为夹竹桃科植物罗布麻L.的干燥叶。根据2020 年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）罗布麻叶项下规定，经广东一方制药有限公司质量中心检定合格，产地信息见表1。2020年版《中国药典》罗布麻叶项下无饮片项，按2018年版《上海市中药饮片炮制规范》罗布麻叶项下规定，将药材除去枝梗等杂质，筛去灰屑，制得19批罗布麻叶饮片（LBMY01～LBMY19）。

表1 19批罗布麻叶样品产地信息

对照品新绿原酸（批号wkq18030107，含量≥98%）、隐绿原酸（批号wkq16081903，含量≥98%），四川省维克奇生物科技有限公司；绿原酸（批号110753-201817，含量96.8%）、金丝桃苷（批号111521-201708，含量95.1%）、异槲皮苷（批号111809-201403，含量92.9%）、槲皮素（批号200081-201509，含量98.6%）、山柰酚（批号110860-201611，含量95.5%），中国食品药品检定研究院。乙醇、甲醇为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；液相用磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）、甲醇（默克股份有限公司）为色谱级，水为超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 罗布麻叶标准汤剂和配方颗粒制备

根据《技术要求》和《医疗机构中药煎药室管理规范》，确定罗布麻叶标准汤剂的制备工艺为：取罗布麻叶饮片100 g，加水煎煮2次。第1次加12倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，第2次加10倍量水，煎煮25 min，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并2次滤液，合并后的滤液转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩为100 mL的浓缩液，冷冻干燥，得标准汤剂冻干粉。

取罗布麻叶饮片3 000 g，加水煎煮2次。第1次加投料量10倍量水，煎煮1.0 h；第2次加投料量8倍量水，煎煮0.5 h，煎液过滤，滤液50～80 ℃减压浓缩为相对密度1.08～1.10（80 ℃）的清膏，过滤，加入适量麦芽糊精，喷雾干燥，再加入适量麦芽糊精和二氧化硅，混匀，干法制粒，制成1 000 g，即得。取3批罗布麻叶饮片（LBMY01、LBMY02、LBMY03）按上述制备3批罗布麻叶配方颗粒（KL01、KL02、KL03）。

2.2 出膏率测定

标准汤剂出膏率（%）＝冻干粉质量÷制备标准汤剂所用的饮片质量×100%。配方颗粒出膏率（%）＝清膏干膏粉量÷饮片投料量×100%。测定结果见表2。

表2 19批罗布麻叶标准汤剂和3批配方颗粒出膏率测定结果（%）

19 批罗布麻叶标准汤剂出膏率范围为25.5%～30.8%，均值为28.8%，标准偏差（SD）＝1.4%。根据《技术要求》，标准汤剂出膏率的允许范围为均值±3SD或均值的70%～130%，出膏率均值±3SD 为24.6%～33.0%，出膏率均值的70%～130%为20.2%～37.5%，结合出膏率数据波动情况，出膏率范围选择均值的70%～均值+3SD较为合理，即罗布麻叶标准汤剂的出膏率可接受范围应为20.2%～33.0%。3批罗布麻叶配方颗粒出膏率分别为28.6%、30.9%、27.9%，均在标准汤剂出膏率范围内，表明配方颗粒的工艺符合要求。

2.3 指标成分含量测定

2.3.1 色谱条件

采用WatersCORTECST3色谱柱（2.1mm×100mm，1.6 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～7 min，6%～12%A；7～11 min，12%～13%A；11～17 min，13%～15%A；17～20 min，15%～19%A；20～25 min，19%～30%A；25～28 min，30%～60%A；28～33 min，60%～75%A），流速0.3 mL/min，检测波长360 nm，柱温35 ℃，进样量1 μL。

2.3.2 对照品溶液制备

精密称取金丝桃苷2.225 mg 和异槲皮苷对照品2.377 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含金丝桃苷211.598 μg和异槲皮苷220.823 μg的混合溶液，摇匀；再精密吸取上述混合溶液3 mL转移至10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含金丝桃苷63.479 μg、异槲皮苷66.247 μg的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.3.3 供试品溶液制备

取标准汤剂冻干粉适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中加70%甲醇25 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 线性关系考察

精密称定金丝桃苷对照品6.325 mg和异槲皮苷对照品8.153 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含金丝桃苷601.508 μg和异槲皮苷757.414 μg的混合对照品贮备液；再精密量取上述金丝桃苷和异槲皮苷混合对照品贮备液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，连同对照品贮备液，分别按“2.3.1”项下色谱条件依次进样1 μL，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，进行线性回归。金丝桃苷回归方程为：＝7 411 511.0＋1 755.0，＝0.999 7，表明在15.038～601.508 μg/mL范围内对照品浓度与峰面积线性关系良好；异槲皮苷回归方程为：＝7 514 521.6＋3 520.8，＝0.999 7，表明在 18.935～757.414 μg/mL 范围内对照品浓度与峰面积线性关系良好。

2.3.4.2 精密度试验

取罗布麻叶标准汤剂（LBMY05）供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，计算RSD，结果金丝桃苷峰面积RSD＝0.19%，异槲皮苷峰面积RSD＝0.17%，表明仪器精密度良好。

2.3.4.3 重复性试验

取同一批罗布麻叶标准汤剂（LBMY05）约0.2 g，精密称定，平行6份，按“2.3.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别进样测定。结果金丝桃苷平均含量为8.86 mg/g，RSD＝0.45%；异槲皮苷平均含量为8.11 mg/g，RSD＝0.40%。表明该方法重复性良好。

2.3.4.4 稳定性试验

取罗布麻叶标准汤剂（LBMY05）供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析，记录峰面积，计算RSD，结果金丝桃苷峰面积RSD＝1.12%，异槲皮苷峰面积RSD＝1.08%，表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4.5 加样回收率试验

精密称定金丝桃苷对照品9.115 mg和异槲皮苷对照品8.926 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含金丝桃苷866.837 μg和异槲皮苷829.225 μg的对照品贮备液。取9个具塞锥形瓶，分为3组，每组3个，依次向3组锥形瓶中精密加入上述对照品贮备液0.5、1.0、1.5 mL，氮气吹干，向每个瓶中加入已知含量的罗布麻叶标准汤剂冻干粉（LBMY05）约0.1 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法制成加样回收供试品溶液9份，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果

2.3.5 样品指标成分含量测定及转移率计算

标准汤剂转移率（%）＝（标准汤剂冻干粉指标成分含量×标准汤剂冻干粉量）÷制备标准汤剂所用饮片指标成分总量×100%；配方颗粒转移率（%）＝配方颗粒中指标成分总量÷制备配方颗粒所用饮片指标成分总量×100%。

按“2.3.3”项下方法，制备19批罗布麻叶标准汤剂供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算金丝桃苷和异槲皮苷的含量和转移率。取罗布麻叶配方颗粒样品适量，研细，取约0.2 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法，制备配方颗粒供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算金丝桃苷和异槲皮苷的含量和转移率。

19 批罗布麻叶标准汤剂金丝桃苷平均含量为0.93%（SD＝0.11%），平均转移率为61.09%（SD＝10.04%）；异槲皮苷平均含量为0.93%（SD＝0.15%），平均转移率为63.67%（SD＝9.33%）。金丝桃苷和异槲皮苷含量波动较大，转移率较稳定，标准汤剂金丝桃苷和异槲皮苷的含量与药材、饮片含量的相关性较高。根据《技术要求》，配方颗粒的含量和转移率应与标准汤剂一致。由于配方颗粒在制备过程中加入了一定的辅料辅助成型，因此，标准汤剂金丝桃苷和异槲皮苷的含量应按照配方颗粒33.3%的制成量进行折算，从而确定配方颗粒的含量范围。19批罗布麻叶标准汤剂按照33.3%的制成量折算成19批配方颗粒的金丝桃苷含量均值为8.02 mg/g，SD＝0.73 mg/g，以均值±3SD作为罗布麻叶配方颗粒金丝桃苷含量的可接受范围，确定罗布麻叶配方颗粒金丝桃苷的含量范围为5.82～10.22 mg/g；按33.3%的制成量折算成19批配方颗粒的异槲皮苷含量均值为8.03 mg/g，SD＝0.94 mg/g，以均值±3SD作为罗布麻叶配方颗粒异槲皮苷含量的可接受范围，确定罗布麻叶配方颗粒异槲皮苷的含量范围为5.20～10.87 mg/g。以均值±3SD作为罗布麻叶标准汤剂和配方颗粒成品的转移率可接受范围，确定金丝桃苷的转移率范围为30.97%～91.20%，异槲皮苷的转移率范围为35.67%～91.66%，结果见表4。3批罗布麻叶配方颗粒金丝桃苷的含量分别为6.9、7.3、6.8 mg/g，异槲皮苷的含量分别为6.6、7.2、6.6 mg/g；3批罗布麻叶配方颗粒金丝桃苷的转移率分别为65.5%、70.7%、62.8%，异槲皮苷的转移率分别为64.0%、69.0%、62.4%。3批罗布麻叶配方颗粒金丝桃苷和异槲皮苷的含量和转移率均与标准汤剂一致，表明配方颗粒的工艺符合要求。

表4 19批罗布麻叶标准汤剂含量测定结果

2.4 特征图谱

2.4.1 色谱条件

同“2.3.1”项下。

2.4.2 对照品溶液制备

取新绿原酸、隐绿原酸、槲皮素和山柰酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20µg的溶液，即得。取绿原酸、金丝桃苷和异槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含50µg的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液制备

同“2.3.3”项下。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 精密度试验

取罗布麻叶标准汤剂冻干粉（LBMY05）研细，取约0.2 g，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件重复进样6次，以绿原酸为参照峰S，计算各共有峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD 为0.09%～0.23%，相对峰面积RSD 为0.13%～2.36%，均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.4.2 稳定性试验

取“2.4.4.1”项下罗布麻叶标准汤剂（LBMY05）供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，以绿原酸为参照峰S，计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD为0.02%～0.65%，相对峰面积RSD为0.28%～2.29%，均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4.3 重复性试验

取同一批罗布麻叶标准汤剂（LBMY05）约0.2 g，精密称定，平行6份，按“2.4.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，以绿原酸为参照峰S，计算各共有峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD 为0.03%～0.75%，相对峰面积RSD 为0.10%～2.61%，均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 标准汤剂指纹图谱

按“2.4.3”项下方法制备19批罗布麻叶标准汤剂（LBMY01～LBMY19）供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录各批标准汤剂指纹图谱，导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件，以LBMY01指纹图谱为参照图谱，进行共有峰标识，并进行保留时间校正和峰匹配（见图1），生成对照图谱（见图2），标定7个共有指纹峰，通过对照品比对全部指认，峰1～峰7依次为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚（见图3）。以峰型较高、分离度较好、对照品易得的绿原酸为参照峰S，计算峰1～峰7与S峰的相对保留时间分别为0.60、1.00、1.12、2.80、2.98、5.05、5.10。各批标准汤剂样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度见表5，均在0.990以上，表明19批罗布麻叶标准汤剂的化学成分差异性较小，质量较稳定。

图1 19批罗布麻叶标准汤剂UPLC图谱

图2 罗布麻叶标准汤剂对照图谱

图3 罗布麻叶标准汤剂指纹图谱共有峰指认

表5 罗布麻叶标准汤剂指纹图谱相似度评价

2.4.6 配方颗粒指纹图谱

按“2.4.3”项下方法，制备3批罗布麻叶配方颗粒（KL01、KL02、KL03）供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录3批配方颗粒样品指纹图谱（见图4），进行共有峰标识，并计算3批配方颗粒样品指纹图谱与罗布麻叶标准汤剂对照指纹图谱的相似度。结果3批配方颗粒呈现与标准汤剂对照指纹图谱保留时间一致的7个共有峰，3批配方颗粒（KL01、KL02、KL03）指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.999、0.999、0.999，表明3批颗粒与标准汤剂的整体相似度较高，质量与标准汤剂一致性较好。

图4 3批罗布麻叶配方颗粒指纹图谱

3 讨论

本试验罗布麻叶标准汤剂制备工艺参照《技术要求》和《医疗机构中药煎药室管理规范》，选用合格的罗布麻叶饮片，以水为提取溶剂，通过对饮片用量、加水量、浸泡时间、煎煮时间、固液分离、浓缩工艺、冷冻干燥工艺等考察，并通过3批工艺验证确定罗布麻叶标准汤剂制备工艺。考察过程采用趁热过滤的方式进行固液分离，过滤后放置在冷水中快速冷却，同时采用低温减压浓缩及冷冻干燥等方法保证煎液质量的稳定，以最大限度与传统汤剂保持一致。

2005年版《中国药典》罗布麻叶项下收载了槲皮素的含量测定，2010、2015、2020年版《中国药典》罗布麻叶项下含量测定指标为金丝桃苷。异槲皮苷、槲皮素是罗布麻叶降血压的主要活性物质，异槲皮苷在罗布麻叶中含量较高且较稳定，因此，本研究在2020 年版《中国药典》基础上增加异槲皮苷为含量指标，以提升罗布麻叶配方颗粒质量标准。

本试验建立了同时测定罗布麻叶中金丝桃苷和异槲皮苷含量及指纹图谱的方法。在方法建立过程中，采用DAD 检测器进行全波长扫描，选取254、275、360 nm作为检测波长进行比较，考察了不同流动相体系（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸）、流动相酸的种类（磷酸、甲酸、乙酸）、不同类型色谱柱[Waters CORTECS UPLC T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）]、不同柱温（33、35、37 ℃）及流速（0.28、0.30、0.32 mL/min）的影响，优选最佳色谱条件，并采用单因素分析法对供试品溶液制备的提取溶剂用量（25、50、100 mL）、提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇）、提取方式（超声、加热回流）及提取时间（30、60、90、120 min）进行考察，确定最佳供试品前处理方法。

本研究共收集6个省份共19批罗布麻叶药材，根据标准汤剂的三大指标（出膏率、有效成分含量及转移率、指纹图谱），制定了罗布麻叶配方颗粒的各指标限度，为罗布麻叶配方颗粒生产工艺的研究提供依据。19批罗布麻叶标准汤剂出膏率、指标性成分的转移率数据都比较稳定，指标性成分的含量与药材、饮片的含量相关性较大，19批罗布麻叶标准汤剂指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.990，表明不同产地的罗布麻叶标准汤剂质量具有较高的一致性。采用UPLC建立的罗布麻叶标准汤剂质量控制参数基本反映了罗布麻叶药材和饮片的质量属性，能够为罗布麻叶配方颗粒质量标准的制定提供依据。3批罗布麻叶配方颗粒出膏率、有效成分含量及转移率、指纹图谱的相似度均与标准汤剂的指标相一致，表明罗布麻叶配方颗粒的生产工艺符合要求，可为罗布麻叶配方颗粒质量标准的建立提供参考。