基于小肠黏膜菌群及肠紧密连接探讨养心通脉方对冠心病血瘀证大鼠的作用机制

王诗，李杰，刘垠杏，张书萌，陈子君，陈伶利，2

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中西医结合病原生物学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208

冠心病的主要病因是冠状动脉粥样硬化致血管腔狭窄，继而心肌缺血，是多数发达国家的主要致死原因之一，在发展中国家也呈增长趋势。血瘀证是冠心病临床上最常见的证型。自2017年“心-肠轴”概念提出后，肠道菌群成为研究心血管疾病与肠道关联性的新靶点。研究表明，冠心病与肠道菌群密切相关，冠心病的危险因素如高血压、高血脂等与也肠道菌群关系密切。

肠道菌群定植于肠道黏膜内，构成肠黏膜屏障，与机体多种代谢产物发生生化作用。目前许多研究直接收集新鲜粪便或肠道内容物进行肠道菌群检测，然而两者并不能直接反映肠道菌群结构，且有研究表明，粪便菌群结构与胃肠道菌群结构存在显著差异，且粪便菌群极易受饮食影响，相较粪便菌群，肠道黏膜菌群能够更真实地反映机体肠道微生物特征。

养心通脉方由国家级中医药名师袁肇凯教授在中医学家秦伯未先生临证经验基础上化裁而成。临床研究发现，养心通脉方可显著改善冠心病心绞痛患者心功能和血流动力学，降低血脂、血糖。本研究采用16S rRNA测序技术分析冠心病血瘀证大鼠小肠黏膜菌群特点，采用透射电镜及Western blot观察大鼠回肠组织紧密连接变化，探讨养心通脉方对冠心病血瘀证大鼠肠道菌群的影响及其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

6～8周龄SPF级雄性SD大鼠95只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号430727201101154332。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF 级动物房，温度（22±2）℃，相对湿度（50±5）%，明暗周期12 h，动物许可证号SYXK（湘）2019-0009。本实验经湖南中医药大学动物伦理委员会审批（XMBH-201907230005）。大鼠高脂饲料（81.3%基础饲料、3%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%白糖、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶），购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 药物

养心通脉方（人参10 g，丹参10 g，桂枝10 g，枳实10 g，泽泻10 g），饮片购于湖南中医药大学第一附属医院，加水煎煮2次，第一次加8倍量水煎煮45 min，第二次加4倍量水煎煮30 min，合并2次煎液，浓缩至原药材浓度为2 g/mL 溶液。阿托伐他汀钙片，批号210823，北京嘉林药业股份有限公司，用蒸馏水配制成浓度为0.4 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

维生素D3（批号J14O10R99577，上海源叶生物科技有限公司），盐酸异丙肾上腺素（批号Z21N10X10 3254，上海源叶生物科技有限公司），Occludin、GAPDH兔多克隆抗体、HRP标记山羊抗兔二抗（货号分别为13409-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2，美国Proteintech公司），粪便基因组DNA提取试剂盒（货号DP328，北京天根生化科技有限公司）。HS-3345全自动组织切片机（金华市华速科技有限公司），EM UC7超薄切片机（德国徕卡公司），HT7700透射电镜（日本日立高新技术公司），电泳仪（美国伯乐公司），ChemiDoC XRS+化学发光凝胶成像仪（美国伯乐公司）。

2 实验方法

2.1 造模

95只大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法分为正常组12只和造模组83只。采用病证结合造模法，参照课题组前期方法，造模组于造模第1、3日灌胃0.5 g/mL维生素D3溶液3 g/kg，造模第5日再灌胃维生素D3溶液2 g/kg。高脂饲料喂养12周后，连续2 d（间隔24 h）皮下注射异丙肾上腺素30 mg/kg。继续高脂饲料喂养2周后进行心电图检测，随机从正常组抽取4只、造模组抽取8只进行血液流变学检测，异常则提示血瘀证造模成功，心电图出现ST段抬高提示冠心病造模成功。

2.2 分组与给药

从造模组大鼠中筛选出48只具有显著冠心病心电图特征的大鼠，将其中24只随机分为模型组、养心通脉方组和阿托伐他汀组，每组8只。养心通脉方组予养心通脉方溶液18 g/kg灌胃，阿托伐他汀组予阿托伐他汀溶液1.8 mg/kg灌胃，正常组和模型组予蒸馏水4 mL/kg灌胃，连续2周，并继续高脂饲料喂养。剩余24只大鼠用于粪菌移植实验。

2.3 粪菌移植实验

参照文献[13]方法，自药物干预第6日起，每日收集各组大鼠新鲜粪便5 g，置于-80 ℃冰箱保存。使用时加入25 mL无菌生理盐水，搅拌均匀后，滤网（270目）过滤，3 000 r/min离心15 min，弃去上清液，沉淀用25 mL生理盐水重悬，即得粪菌液（0.2 g/mL）。将剩余24只造模大鼠随机分为正常大鼠粪菌移植组、模型大鼠粪菌移植组和养心通脉方大鼠粪菌移植组，每组8只，分别予正常组大鼠粪菌液、模型组大鼠粪菌液、养心通脉方组大鼠粪菌液1 g/kg灌胃，连续2周，并继续予高脂饲料喂养。

2.4 取材

干预结束后，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉大鼠，无菌条件下打开大鼠腹腔，自回盲瓣向上取回肠组织约8 cm，无菌PBS缓冲液清洗，迅速置于干冰中速冻，转至-80 ℃超低温冰箱中保存。每组随机选取3只大鼠，剪开大鼠胸腔，剪取完整心脏，生理盐水冲洗后，置于4%多聚甲醛中固定。

2.5 冠状动脉组织病理观察

4%多聚甲醛固定心脏组织48 h，常规石蜡包埋，切片，HE染色后显微镜下观察冠状动脉病理变化。采用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，依据美国心脏协会标准计算冠状动脉粥样硬化斑块百分比（斑块总面积÷血管总截面积×100%，斑块总面积为血管内膜到中膜弹力层的范围）。

2.6 回肠黏膜菌群16S rRNA测序及生物信息分析

从冰箱中取出回肠组织，解冻后用无菌盖玻片刮取附着在回肠黏膜表面的细菌，按照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取DNA，液氮速冻后转至-80 ℃超低温冰箱保存，用于16S rRNA测序。采用Illumina NovaSeq平台对测序样本进行双端测序，测序数据分析使用QIIME2 软件，使用QIIME2 推荐的DADA2 方法去噪去嵌合，选取OTU 的代表性序列，与微生物物种注释数据库Greengenes Database 13_8比对获得物种注释信息。

2.7 回肠组织电镜观察

低温下将回肠组织切成1～2 m小块，置于2.5%戊二醛溶液中固定4 h，梯度乙醇脱水，丙酮-812包埋剂（2∶1）渗透过夜，纯812包埋剂包埋8 h，超薄切片机切片（厚度60～80 nm），2%醋酸铀和枸橼酸铅各染色15 min，置于透射电镜下观察。

2.8 Western blot检测

取适量回肠组织，加入裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，100 ℃加热10 min。蛋白上样量100 μg，电泳，200 mA转膜1 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入Occludin（1∶1 000）、GAPDH（1∶8 000）一抗，4 ℃孵育过夜，滴加二抗（1∶8 000），37 ℃孵育1.5 h，TBST洗膜，凝胶成像仪中显影，采用Image J软件计算蛋白相对表达量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 养心通脉方对模型大鼠冠状动脉组织病理形态的影响

正常组大鼠冠状动脉组织形态完整，细胞排列规则，未见明显病理改变；模型组大鼠冠状动脉组织内膜增生，有纤维帽沉积并向管腔突起，管腔呈新月形狭窄，内膜下有大量空泡状噬脂细胞，病变累及中膜肌层组织；养心通脉方组大鼠冠状动脉组织内膜结构较完整，内膜下沉积少量噬脂细胞，病变显著改善；阿托伐他汀组大鼠冠状动脉组织管腔较狭窄，内膜下可见明显噬脂细胞沉积。见图1。

图1 各组大鼠冠状动脉组织形态（HE染色，×200）

与正常组比较，模型组大鼠冠状动脉粥样硬化斑块百分比显著升高（＜0.01）；与模型组比较，养心通脉方组大鼠冠状动脉粥样硬化斑块百分比显著降低（＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠冠状动脉粥样硬化斑块百分比比较（，%）

4.2 养心通脉方对模型大鼠肠道菌群的影响

4.2.1 Alpha多样性分析

Alpha多样性包括丰富度指数Chao1和均匀度指数Shannon。与正常组比较，模型组大鼠肠道菌群Shannon显著降低（＜0.05），Chao1有降低趋势，但差异无统计学意义（＞0.05）；与模型组比较，养心通脉方组大鼠肠道菌群Chao1、Shannon显著升高（＜0.05，＜0.01），阿托伐他汀组大鼠肠道菌群Shannon显著升高（＜0.01），其余各组差异无统计学意义（0.05）。见图2。

图2 各组大鼠肠道菌群Alpha多样性比较（，每组8只）

4.2.2 Beta多样性分析

Beta多样性能反映各组之间菌群结构的相似性和差异性，Unweighted Unifrac距离基于物种系统进化关系，Bray Curtis距离仅考虑物种存在与否及其丰度，两者是估算微生物群落样本间距离的方法，样本间相似性越高，距离数值越小。Unweighted Unifrac 和Bray Curtis距离可以用非度量多维尺度法（NMDS）和主坐标分析（PCoA）在二维或三维空间进行排序展示，体现菌群群落的空间分布。各组Unweighted Unifrac距离和Bray Curtis距离差异有统计学意义（q＜0.05），提示各组大鼠肠道菌群结构有显著差异，正常组和模型组大鼠肠道菌群结构差异较大，养心通脉方组与正常组肠道菌群结构相似，与阿托伐他汀组菌群结构也具有一定相似性。粪菌移植实验中，模型大鼠粪菌移植组与正常大鼠粪菌移植组肠道菌群结构差异较大，养心通脉方粪菌移植组和正常大鼠粪菌移植组肠道菌群结构相似。见图3、图4。

图3 各组大鼠肠道菌群NMDS分析

图4 各组大鼠肠道菌群PCoA分析

4.2.3 菌群结构分析

16S rRNA测序共获得2 096 791条原始序列，去除原始序列中的非特异性扩增片段和嵌合体后，每组获得平均有效序列69 889～116 057 条，与Greengenes Database 13_8 数据库比较，各组测序覆盖率＞98%，说明测序结果可反映样本的真实情况。门分类水平上丰度排名前3位是变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、酸杆菌门Acidobacteria。与正常组比较，模型组大鼠肠道菌群厚壁菌门Firmicutes丰度显著降低（＜0.01），变形菌门Proteobacteria丰度显著升高（＜0.01）。与模型组比较，阿托伐他汀组大鼠肠道菌群厚壁菌门丰度显著升高（＜0.05），变形菌门丰度显著降低（＜0.05）；养心通脉方组大鼠肠道菌群厚壁菌门丰度有升高趋势，变形菌门丰度有降低趋势，但差异无统计学意义（＞0.05）；正常大鼠粪菌移植组大鼠肠道菌群厚壁菌门丰度显著升高（＜0.05），变形菌门丰度显著降低（＜0.01），提示粪菌移植可以重塑冠心病血瘀证大鼠肠道菌群。属水平上丰度排名前3位是罗尔斯通菌属，未鉴别的消化链球菌科菌属，未鉴别的梭菌目菌属。见图5、表2。

表2 各组大鼠肠道菌群相对丰度比较（，%）

图5 各组大鼠肠道菌群物种分布

厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值与肠道菌群稳态有关，比值升高或降低表明肠道菌群失衡。与正常组比较，模型组大鼠肠道菌群F/B 比值显著降低（＜0.05）；与模型组比较，养心通脉方组和阿托伐他汀组大鼠肠道菌群F/B 比值升高，但差异无统计学意义（＞0.05）；与模型大鼠粪菌移植组比较，养心通脉方粪菌移植组大鼠肠道菌群F/B比值升高，但差异无统计学意义（＞0.05）。

4.2.4 差异物种筛选

LefSe分析可直接对不同组间样品所有分类水平同时进行差异分析，找出差异物种。LDA score越大，表示差异物种的影响越大。由图6可见，LDA score＞2的差异物种共31种，致病菌变形菌门Proteobacteria对模型组有显著影响（LDA score＞5.5），有益菌厚壁菌门Firmicutes对正常组有显著影响（LDA score＞5.5），有益菌泉古菌门Crenarchaeota对养心通脉方组有显著影响（LDA score＞4），有益菌乳杆菌科Lactobacillaceae对阿托伐他汀组有显著影响（LDA score＞4.5）。各组特征菌群的分类水平所属关系见图7，可以推断菌群的进化关系。模型组目水平有嗜甲基菌目Methylophilales和甲基球菌目Methylococcales 2个物种，科水平有嗜甲基菌科Methylophilaceae等3个物种；养心通脉方组目水平有亚硝基球菌目Nitrososphaerales 1个物种，科水平有亚硝基球菌科Nitrososphaeraceae 1个物种。

图6 各组大鼠肠道菌群LDA score分布

图7 各组大鼠肠道菌群环形进化图

4.3 养心通脉方对模型大鼠回肠组织超微结构的影响

透射电镜观察显示，正常组大鼠回肠组织紧密连接，桥粒结构清晰，形态完整，微绒毛排列密集整齐；模型组大鼠回肠组织紧密连接减少，结构模糊不清，桥粒数量减少，微绒毛排列稀疏；养心通脉方组和阿托伐他汀组大鼠回肠组织紧密连接有所改善，结构较清晰，桥粒数量增多。见图8。

图8 各组大鼠回肠组织超微结构

4.4 养心通脉方对模型大鼠回肠组织Occludin 蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠回肠组织Occludin蛋白表达显著降低（＜0.05）；与模型组比较，养心通脉方组和阿托伐他汀组大鼠回肠组织Occludin蛋白表达显著升高（＜0.05，＜0.01），提示养心通脉方可以重建回肠屏障功能。见图9、表3。

图9 各组大鼠回肠组织Occludin蛋白免疫印迹

表3 各组大鼠回肠组织Occludin蛋白表达比较（）

5 讨论

冠心病属中医学“胸痹”“真心痛”范畴目前西医治疗冠心病主要采用钙通道拮抗剂、硝酸酯类、β-肾上腺素受体阻滞剂、抗血小板药物、降脂类药物（阿托伐他汀），但长期服用会导致不良反应。老年冠心病患者经介入治疗，术后5年内生存率仅70%。养心通脉方以“扶养心气，疏通血脉”为基本治法，方中人参补益心气，丹参行气活血、化瘀通脉，桂枝助阳化气、温通血脉、理气活血，枳实理气消痰，泽泻利水补阴。全方标本兼治、通补兼施，共奏补气益气、养阴生津、养心通脉、活血化瘀功效。现代药理研究表明，人参主要活性成分人参皂苷类具有抗氧化、抑制血栓形成、抑制炎症反应等作用；丹参主要活性成分丹参酮类和丹酚酸类具有抗血小板聚集、抗氧化应激、抗炎、降糖功效；枳实活性成分黄酮和挥发油类抗氧化能力极佳；泽泻主要活性成分三萜类具有降脂、降糖功能。

本研究从冠心病血瘀证模型大鼠回肠黏膜菌群状态出发，进行药物干预和粪菌移植实验。结果显示，模型组大鼠肠道菌群有益菌厚壁菌门丰度减少，致病菌变形菌门丰度增加；养心通脉方组大鼠肠道菌群厚壁菌门丰度增加，变形菌门丰度减少，菌群结构趋于正常，提示养心通脉方可能通过调节模型大鼠肠道菌群，恢复紊乱的肠道微生态，进而治疗冠心病血瘀证。

Occludin 蛋白通过招募闭锁小带蛋白-1（ZO-1）调节细胞之间连接，维持肠道屏障功能。研究表明，肠道菌群失调会导致Occludin蛋白表达下调。本研究中，养心通脉方能上调模型大鼠回肠组织Occludin蛋白表达。透射电镜观察显示，养心通脉方组回肠组织紧密连接较完整，桥粒数量增多，提示养心通脉方能够改善肠道黏膜细胞间连接，修复肠道机械屏障功能。

本研究筛选出30余种差异肠道菌群，这些肠道菌群可能与疾病和中药作用机制有紧密联系，具有深入研究的意义和价值。本研究肠道菌群LDA score分布显示，泉古菌门是养心通脉方组的优势菌群，目前泉古菌门与疾病之间的关联还不明确，中药、肠道菌群和冠心病三者之间相互联系的靶点也尚不清楚，有待今后进一步研究。