促进草酸青霉降解秸秆的表面活性剂效果研究

万文，杨天杰，樊晓腾，2，郑海平，王世梅，韦中，徐阳春*，沈其荣

（1.南京农业大学资源与环境科学学院/江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心/资源节约型肥料教育部工程研究中心/国家有机类肥料工程技术研究中心，南京 210095；2.河南师范大学，河南 新乡 453000）

我国每年产生各类作物秸秆近9亿t，而秸秆中含有丰富的有机物及氮、磷、钾等营养物质，具有很高的潜在利用价值。因此，对秸秆进行高效资源化利用成为我国发展绿色循环农业中亟待解决的问题。秸秆还田是其资源化利用的主要途径之一，该方法有利于土壤腐殖质的更新和土壤有机质的积累，起到培肥地力、促进作物生长的作用。但秸秆直接还田的降解效率低、耗时长，常需要添加秸秆降解菌以提高秸秆的降解效率。由于秸秆表面存在蜡质层，秸秆降解菌难以接触和附着在秸秆上，无法产生大量纤维素类酶；蜡质层也阻碍了纤维素类酶与秸秆的接触，造成秸秆降解菌效率降低或施用效果不稳定。近年来，许多研究通过添加秸秆降解助剂（如表面活性剂）来提高秸秆降解菌产酶量，从而提高秸秆降解效率。

表面活性剂是指一类具有固定的亲水亲油基团、在溶液表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。与阴离子、阳离子表面活性剂相比，非离子表面活性剂稳定性更高，乳化、润湿和洗涤的能力更强。周梅芳发现表面活性剂能够提高简青霉产漆酶的能力。孟杰等的研究表明表面活性剂能在一定程度上激发纤维素分解菌的活性，可改善堆肥环境，促进微生物生长和提高纤维素类酶活性。这些研究均表明，添加表面活性剂能够促进秸秆降解菌的产酶能力，从而提升秸秆的降解效率，但尚未有研究比较不同种类的表面活性剂对秸秆降解菌降解秸秆效果的影响，表面活性剂的浓度是否会影响纤维素类酶活性也有待进一步研究。

因此，为了提高降解菌秸秆降解的效率，本研究以玉米秸秆为研究对象，筛选出一株降解秸秆能力较强的菌株——草酸青霉Z7-6，研究4种不同非离子表面活性剂对其降解玉米秸秆的影响。首先利用液体发酵方法，考察不同浓度、不同种类的表面活性剂对秸秆降解菌利用玉米秸秆及产纤维素类酶的影响，筛选出表面活性剂的最佳浓度；再利用固体发酵体系进行效果验证，最终获得配合高效玉米秸秆降解菌的最佳表面活性剂种类及浓度。该研究可为表面活性剂作为降解秸秆助剂提供理论依据，并为提高秸秆降解效率提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 土样

供试土壤采自江苏省金坛区朱林镇秸秆直接还田地块，该地块为稻麦轮作，稻麦秸秆均全量还田。

1.1.2 玉米秸秆

秸秆采自江苏省宜兴市紫云山生态园。用清水将玉米秸秆表面尘土洗净并风干，除去叶片、叶鞘和根部后，切成1～3 cm的小段，65℃烘干至恒质量备用。

1.1.3 表面活性剂

吐温80（Tween 80，TW）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，TR）、3-[甲氧基聚（乙氧基）]丙基-甲基-双（三甲基硅氧基）硅烷（MT）购自国药化学集团试剂公司，聚醚硅氧烷（PP）购自江苏龙灯化学集团公司。

1.2 供试培养基

本研究主要采用以下4种培养基进行降解菌的筛选和活性检测：无机盐培养基用于秸秆降解菌的初筛；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar，PDA）用于真菌的纯化培养；产酶培养基和羧甲基纤维素（Carboxymethyl cellulose，CMC）-刚果红培养基用于秸秆降解菌酶活性的检测。其他培养基配方为：秸秆液体发酵培养基，每100 mL无机盐培养基中添加1.5 g玉米秸秆段；秸秆固体发酵培养基，每100 mL无机盐培养基中添加25.0 g玉米秸秆段，秸秆达到手握成团、落地即散的状态。

以上培养基均经过115℃高压灭菌30 min后备用。

1.3 秸秆降解菌的筛选

秸秆降解菌初筛：称取1.0 g秸秆样品至装有90 mL无菌水的三角瓶中，于170 r·min、30℃下振荡30 min后，静置30 min。吸取上清液稀释后涂布于含有10.0 g玉米秸秆粉的无机盐固体培养基上，30℃静置培养3～5 d，直至出现单菌落。挑取在无机盐固体培养基上生长旺盛的真菌菌丝，转接至PDA培养基，连续划线培养后得到纯化的菌株，与40%甘油等体积混合并保存于-80℃冰箱。将初筛获得的6个菌株在PDA培养基上活化后，接种于PDA液体培养基中，30℃、170 r·min振荡培养12 h，用无菌水调整各菌株孢子浓度至10CFU·mL，取10 µL菌液接种于CMC-刚果红固体平板上，置于30℃培养箱静置培养3 d，测定菌落直径（）和透明圈直径（），计算/值，该比值越大表明菌株水解CMC的能力越强。每个菌株3个重复。

秸秆降解菌的复筛：将初筛获得的菌株接种至含50 mL PDA液体培养基的三角瓶中，30℃静置培养7 d至其表面产生大量孢子。加入30 mL无菌水后在摇床上振荡30 min，用无菌纱布过滤培养物后，加入无菌水调节孢子浓度为10CFU·mL，即得孢子接种液。按1%（∶）接种量将各菌株孢子液接种至秸秆液体发酵培养基中，于30℃、170 r·min下振荡培养7 d。每个菌株设3个重复。将降解后的秸秆残渣在网孔为0.1 mm的尼龙网袋内用大量清水冲洗，除去秸秆上附着的菌丝及其他可溶物，剩余秸秆残渣在65℃下烘干至恒质量，称量秸秆残留物干质量，计算秸秆相对降解率（Relative degradation rate，）：

式中：为对照组秸秆剩余物干质量，g；为处理组秸秆剩余物干质量，g。

秸秆降解菌株的鉴定：从平板上刮取真菌菌丝，加入液氮研磨，以加速细胞壁破碎。采用OMEGA真菌基因组提取试剂盒提取供试菌株的总DNA。用ITS引物对菌株的ITS基因片段进行PCR扩增，引物分别为ITS1（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR反应体系（50 µL）如下：DNA模板1 µL，dNTP（2.5 mmol·L）4 µL，引物（1 mmol·L）各1 µL，10×Loading Buffer 5 µL，MgCl（25 mmol·L）3 µL，Taq酶（5 U·µL）0.5µL，ddHO 34.5µL。PCR扩增程序为：94℃5 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃1 min，共30个循环；72℃10 min。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将PCR产物送至上海美吉生物公司测序。测序结果在NCBI（https：//ncbi.nlm.nih.gov/）中进行BLAST比对，选取同源性大于97%的序列在MEGA 7.0软件中分析菌株同源性，采用邻近法（Neighbor-joining method）构建菌株系统发育树，确定菌株的分类地位。

1.4 添加表面活性剂试验

4种表面活性剂TW、TR、MT和PP分别设置0.1%（∶）和0.5%（∶）两个浓度，以不添加表面活性剂为对照，共设置9个处理，每个处理3个重复。通过液体发酵筛选表面活性剂的最佳浓度，考察不同表面活性剂在不同浓度下对秸秆降解菌降解玉米秸秆的效果，最后采用固体发酵进行验证。

添加表面活性剂的秸秆液体发酵试验：参照1.3中的方法制备浓度为10CFU·mL的孢子接种液。按1%（∶）接种量将降解菌孢子悬液接种于含有不同浓度表面活性剂的秸秆液体发酵培养基中，置于30℃摇床中170 r·min振荡培养7 d。参照1.3中的方法测定秸秆相对降解率。取发酵液经10 000 r·min离心10 min后取上清液，即为粗酶液。用DNS法测定粗酶液的滤纸酶（FPA）、羧甲基纤维素酶（CMCase）和木聚糖酶（Xylanase）活性，将1 min内水解生成1µmol还原糖所需的酶量定义为一个活力单位（U）。

添加表面活性剂的秸秆固体发酵试验：参照1.3中的方法制备浓度为10CFU·mL的孢子接种液。按1%（∶）接种量将降解菌孢子悬液接种于含有不同表面活性剂的秸秆固体发酵培养基中，控制固体培养基的含水量为75%，在30℃培养箱中静置培养30 d后取样测定秸秆相对降解率和滤纸酶、羧甲基纤维素酶、木聚糖酶活性。

1.5 数据处理

数据分析采用R 4.0.2版本（https：//www.r-project.org）。采用agricolae包进行数据的统计分析，通过ggplot2包进行数据的可视化。数据分析采用单因素方差分析（ANOVA），利用Tukey HSD检验法检验处理间的差异显著性（＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 秸秆降解菌株Z7-6的筛选及鉴定

采用以玉米秸秆粉为唯一碳源的无机盐固体培养基，从秸秆直接还田的土壤样品中分离纯化得玉米秸秆降解菌共6株，在刚果红培养基上产透明降解圈的效果如表1和图1a所示。结果表明，菌株Z7-6在CMC-刚果红平板上的脱色效果更为明显，相对降解率达40.58%，显著高于其他5个菌株（=129.3，＜0.001），其/值显著高于其他菌株（=13 988，＜0.001）。对菌株Z7-6进行菌种鉴定，ITS分析结果表明其为草酸青霉（）（图1b）。

图1 秸秆降解菌对玉米秸秆的降解效果以及菌株鉴定结果Figure 1 Degradation effects of straw degrading microbes and strain identification

表1 秸秆降解菌的降解圈（D）与菌落直径（d）Table 1 The degradation circle（D）and colony diameter（d）of straw degrading microbes

2.2 表面活性剂对草酸青霉Z7-6液体发酵的影响

0.1 %浓度的表面活性剂处理下的秸秆相对降解率高于0.5%浓度，除TW处理外，其他3种表面活性剂 均 达 到显 著 差异（MT：=103.8，＜0.001；PP：=105.9，＜0.001；TR：=87.4，＜0.01，图2a）。不同表面活性剂处理下，0.1%TR处理的秸秆相对降解率最高，达61.36%，显著高于不加表面活性剂的对照处理（=66.63，＜0.001），较其提高了60%，但与0.1%TW相比差异不显著（＞0.05）。以上结果表明，较低浓度（0.1%）的表面活性剂提升草酸青霉Z7-6降解秸秆的效果更佳，其中0.1%TR与0.1%TW处理的效果最好。

进一步检测各处理对草酸青霉Z7-6分泌纤维素类酶活的影响，结果表明，各表面活性剂对滤纸酶、羧甲基纤维素酶、木聚糖酶活性的影响基本一致，即0.1%浓度的表面活性剂处理下均显著高于0.5%浓度处理（＜0.001，图2b～图2d）。所有处理中，0.1%TR处理的滤纸酶和CMC酶活性均最高，滤纸酶活性为42.01 U·gds，CMC酶活性为174.30 U·gds，均显著高于其他处理（滤纸酶：=12 876，＜0.001；CMC酶：F=4×10，＜0.001，图2b、图2c）。0.1%TW处理下木聚糖酶活性最高，但与0.1%TR处理无显著差异。与对照相比，0.1%TR处理的滤纸酶、CMC酶和木聚糖酶活性分别提高了213.74%、155.27%和115.24%。

图2 液体发酵条件下表面活性剂对草酸青霉Z7-6降解秸秆及产酶能力的影响Figure 2 Effects of surfactant on strain Z7-6 degradation and enzyme activities

以上结果表明，较低浓度的表面活性剂可提高滤纸酶、CMC酶和木聚糖酶的活性，其中0.1%TR处理效果最佳；而较高浓度的表面活性剂可降低部分纤维素类酶的活性，如0.5%MT和0.5%PP抑制了CMC酶活性和木聚糖酶活性。

为了分析液体发酵时表面活性剂种类、浓度以及3种产纤维素类酶活性对草酸青霉Z7-6相对降解率的交互作用，对其进行了广义线性分析。由表2可知，表面活性剂的种类和浓度对草酸青霉Z7-6的秸秆相对降解率均有显著影响（＜0.001），且表面活性剂浓度与秸秆相对降解率间存在显著的负相关（＜0.001），表明在本研究中表面活性剂浓度越高，秸秆相对降解率越低。但表面活性剂对菌株降解秸秆的影响是否存在浓度效应，需增加表面活性剂浓度梯度进一步验证。

表2 液体发酵条件下表面活性剂种类、浓度和酶活性的交互作用对秸秆相对降解率的影响Table 2 Interactive effects of type and concentration ofsurfactants and enzyme activity on relative degradation rate under liquid fermentation condition

3种产纤维素类酶活性与秸秆相对降解率的相关性结果表明，只有CMC酶活性与秸秆相对降解率呈显著正相关关系（=0.028），表明CMC酶活性可显著促进草酸青霉Z7-6降解玉米秸秆的能力。但表面活性剂种类、浓度和3种产纤维素类酶对秸秆相对降解率均无交互作用（＞0.05），表明表面活性剂的种类和浓度并非通过线性关系影响产纤维素类酶活性，进而影响秸秆降解能力。

2.3 表面活性剂对草酸青霉Z7-6固体发酵的影响

为了验证0.1%浓度的4种表面活性剂对草酸青霉Z7-6降解玉米秸秆的实际效果，开展模拟秸秆还田时添加菌剂的固体发酵试验。研究结果表明，0.1%TR处理下草酸青霉Z7-6对玉米秸秆的降解能力最强，达69.67%，0.1%TW处理次之，0.1%MT和PP的效果最差，但仍高于对照处理；0.1%TR处理的相对降解率显著高于其他3种表面活性剂，与对照相比，该处理秸秆的相对降解率提高了41.87%（图3a）。

0.1 %表面活性剂对3种纤维素类酶活性的影响相似（图3b～图3d）。0.1%TR处理下滤纸酶、CMC酶以及木聚糖酶活性最高，滤纸酶活性达3.51 U·gds，CMC酶活性达25.55 U·gds，木聚糖酶活性达1 429.00 U·gds；该处理的滤纸酶和木聚糖酶活性显著高于0.1%TW处理（图3b、图3d）。与对照相比，0.1%TR处理的滤纸酶、CMC酶和木聚糖酶的活性分别提高了70.39%、45.33%和75.10%。

图3 表面活性剂对草酸青霉Z7-6降解秸秆能力以及产酶活性的影响Figure 3 Effects of surfactants on straw degradation and enzyme activities ability of strain Z7-6

以上结果表明，0.1%浓度的4种表面活性剂均可提高草酸青霉Z7-6降解玉米秸秆的能力，其中0.1%TR效果最佳，对3种纤维素类酶的活性有显著的促进作用。

3 讨论

秸秆还田是目前秸秆资源化利用最常用的方式之一，但由于还田秸秆总量巨大且多为就地还田，即使施用秸秆降解菌，也会因秸秆表面的蜡质层阻碍菌株与秸秆的接触而降低秸秆降解效率。研究发现将表面活性剂用作助剂可以加速秸秆的降解。木质纤维素具有强疏水性，添加表面活性剂后，可改变其疏水特性，降低木质素对纤维素酶的无效吸附，使秸秆更好地与降解菌或酶相结合。非离子表面活性剂预处理能增大纤维素酶的可利用表面，增加纤维素吸附酶的反应位点，有效稳定酶的性质，提高秸秆的糖化率。表面活性剂还可增加细胞膜的通透性，加速蛋白质类物质（如酶类）的跨膜运输，增加胞外纤维素酶的浓度，进而提高微生物降解秸秆的能力。本研究中，秸秆降解效果较好的处理，其纤维素酶活性更高，推测表面活性剂可能增加了草酸青霉Z7-6细胞的通透性，加大了秸秆对酶的吸附作用。后期可通过检测微生物细胞内外和秸秆表面的纤维素酶含量进行验证。

目前，已有非离子表面活性剂对秸秆降解影响的相关研究，但尚未进行不同种类非离子表面活性剂效果的比较。本研究发现，不同种类的非离子表面活性剂对草酸青霉Z7-6降解玉米秸秆的影响不同。Triton X-100处理的秸秆降解效果最佳，草酸青霉Z7-6产纤维素类酶活性也显著增加；吐温80处理次之。与吐温系列的表面活性剂相比，Triton X-100亲水基团数更多，具有更高的临界胶束浓度（Critical micelle concentration），亲水性更强，可更好地与木质素结合；其特殊的结构可稳定水解酶结构，即使在低浓度下（0.02%）也能提升水解酶活性。多项研究表明，Triton X-100促进里氏木霉溶胀素-木聚糖酶融合酶活性的能力优于吐温20；Triton X-100处理后对稻秆酶解的效果也优于吐温80。

本研究还发现表面活性剂浓度较低时（0.1%），玉米秸秆降解效果更好，纤维素类酶的活性也更高。尤其是较高浓度的MT和PP反而抑制了草酸青霉Z7-6的部分纤维素类酶活性。这可能是由于发生了产物抑制作用，即表面活性剂浓度增高，降解菌分泌纤维素类酶增多，产生更多的秸秆降解物，反而抑制了相关酶的活性。也有研究表明，高浓度的表面活性剂会显著抑制外切酶的活性，破坏酶的活性构象而使其丧失活性；同时酶解体系中形成胶束，降低了纤维素酶的可及度，抑制了总酶活性。此外，表面活性剂含量过高可能会影响菌体的正常代谢，从而影响菌株的产酶功能，导致酶活性降低。因此，在后期研究中可尝试更低浓度的表面活性剂，确定每种表面活性剂的最佳使用浓度，节省成本的同时也可提高秸秆降解效率。

近年来，在秸秆降解领域对表面活性剂的研究逐渐增多，使用较多的主要是生物表面活性剂和非离子表面活性剂。虽然生物表面活性剂对秸秆降解的促进效果十分显著，但其制得率较低，难以规模化生产，且在应用过程中受环境影响较大，稳定性较低。本研究中所用的表面活性剂为化学纯品，易配制、效果稳定，因此，非离子表面活性剂可作为秸秆降解预处理较为合理、高效的方式之一。本研究表明0.1%Triton X-100对草酸青霉Z7-6秸秆降解的提升作用最强，其对纤维素类酶活性的促进效果最佳，可作为潜在的秸秆降解表面活性剂。

4 结论

本研究筛选出一株对玉米秸秆降解能力较好的菌株——草酸青霉Z7-6，分别在液体和固体发酵条件下，通过比较4种表面活性剂在不同浓度下对草酸青霉Z7-6降解秸秆的影响发现，0.1% Triton X-100提升草酸青霉Z7-6降解秸秆的效果最佳，同时使滤纸酶、羧甲基纤维素酶、木聚糖酶的活性得到提升。