基于网络药理学的北豆根治疗溃疡性结肠炎的作用机制

张科，宋崟，李波，谷冬梅，李正翔，袁恒杰

作者单位：天津医科大学总医院，a药剂科，b检验科，天津 300052

溃疡性结肠炎（ulcerative Colitis，UC）是一种病情复杂，病程较长，主要累及结肠的非特异性炎症反应疾病，临床很难根治［1］。目前治疗以药物治疗为主，常用药物包括氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂等，但治疗效果并不理想，且存在明显的不良反应［2］。北豆根又名蝙蝠葛根，为防己科植物蝙蝠葛（Menispermum dauricum DC.）的干燥根茎［3］，其性寒味苦，有小毒，归大肠、胃、肺经，具有祛风止痛和清热解毒等功效，常用于咽喉肿痛、热毒泻痢、风湿痹痛等疾病的治疗［4］。临床很多含有北豆根的中药方剂，对肠炎都有一定疗效。相关试验也证实：北豆根单味药原液，可以通过降低IL-6、MMP 和VEGF 水平发挥对UC 模型大鼠的治疗作用［2］；近年来，网络药理学发展迅速，该方法可以全面、系统对中药多成分、多靶点作用机制进行阐释［5］。本研究拟采用该方法探究北豆根治疗UC 的作用机制，为其在临床研究提供依据。

1 方法

1.1 北豆根化学成分与对应靶点的收集与筛选打开TCMSP 数据库，以“北豆根”为关键词检索，收集药材的化学成分。口服生物利用度（OB）是指药物经血管外途径给药后吸收进入全身血液循环的相对量，其与药物疗效密切相关。药物相似性（DL）指化合物与已知药物的相似性，DL高的的化合物并不是药物，但具有成为药物的可能。研究显示：药物研发过程中OB 和DL 的好坏是决定目标分子是否筛选进入研究下一步的关键参数［6］。本研究以OB≥30%和DL≥0.18［7］为条件筛选有效成分；最后，收集数据库中成分对应的靶点。打开Uniprot 数据库，选择UniprotKB ，输入检索式为“reviewed：yes AND organism：Homo sapiens（Human）”进行检索，获得20394 条人类的相关靶蛋白及对应基因的信息，以Excel 格式导出，再使用“VLOOKUP”函数进行匹配，将靶点转换便于分析的标准基因名。

1.2 UC 治疗靶点的筛选 打开Genecards 数据库，以“ulcerative colitis”为关键词检索，收集UC 疾病靶点，以Excel 格式导出，然后将“1.1”节中北豆根的成分靶点的标准基因与疾病靶点基因取交集。

1.3 “药物-有效成分-靶点”网络的构建与分析 将药物、有效成分和交集基因数据处理后，导入Cytoscape 3.2.1 软件中绘制“药物-有效成分-靶点”网络图，其中不同类型节点分别代表北豆根、有效成分和靶点，边代表三者之间的关系。然后对网络进行拓扑结构分析，再根据节点连接度（Degree）和介数中心性（Betweenness Centrality，BC）对网络图进行调整，节点的大小反映Degree 的大小，边的粗细反映BC的大小［7］。

1.4 PPI 网络的构建与核心靶点的筛选 将“1.2”节的交集基因导入STRING 数据库绘制蛋白-蛋白互作网络图（protein-protein interaction，PPI），将分析数据以TSV 格式导出，导入Cytoscape3.2.1 软件，绘制北豆根与UC 靶点的PPI 网络图，并对网络进行拓扑结构分析；再利用“Generate style from statistics”工具对网络节点的大小和颜色进行设置。网络图中节点的大小、颜色及其深浅变化代表Degree 值的大小，边的粗细反映了Combine Score 的大小，从中筛选出Degree 值和接近中心度排名靠前的靶点作为核心靶点。

1.5 基因功能注释分析和功能富集分析 将1.2节的交集基因导入DAVID 数据库，并限定物种为人，进行基因功能注释分析和功能富集分析，然后导出数据，对生物过程（P＜0.01）和信号通路（P＜0.05）进行筛选，并进行绘图。

2 结果

2.1 北豆根有效成分及靶点的确定 检索得到北豆根化学成分31 个，以OB≥30%和DL≥0.18 为条件筛选出有效成分10 个，包括蝙蝠葛碱、叶含去羟尖防己碱、蝙蝠葛辛碱、山豆根碱、山豆根波芬诺灵碱、汉防己碱、光千金藤碱、光千金藤定碱、北豆根碱、碎叶紫堇碱，具体信息见表1。检索得到10个成分对应靶点175个：蝙蝠葛碱作用靶点2个，叶含去羟尖防己碱作用靶点2 个，蝙蝠葛辛碱作用靶点26个，山豆根波芬诺灵碱作用靶点24 个，汉防己碱作用靶点25 个，光千金藤碱作用靶点27 个，光千金藤定碱作用靶点30 个，北豆根碱作用靶点10 个，碎叶紫堇碱作用靶点29个，山豆根碱没有对应靶点。将所得靶点蛋白名称转换为标准基因名，删除重复和无效靶点，共获取北豆根活性成分作用靶点78个。

表1 北豆根中10个有效成分的基本信息

2.2 UC 治疗靶点的筛选结果 Genecards 数据库检索到UC 疾病靶点3982 个，将北豆根有效成分靶点和UC 疾病靶点取交集，得到交集基因44个，作为北豆根治疗UC 的“关键靶点”，见图1。

2.3 “药物-有效成分-靶点”网络分析结果“药物-有效成分-靶点”网络图共包括55 个节点（1 个药物节点，10 个活性成分节点、44 个靶点节点）和229 条边，见图2。对网络图进行拓扑分析显示：蝙蝠葛辛碱、山豆根波芬诺灵碱、汉防己碱、光千金藤碱、光千金藤定碱、北豆根碱能与9个以上的靶点相连接，推测这6个成分是北豆根治疗UC的主要有效成分。

2.4 PPI 网络的分析 PPI 网络包含43 个节点（其中HPSE 靶点与其他靶点没有连接关系）和260 条边，平均节点Degree 值为11.8。该网络中度值（Degree）排名前10 的靶点包括：IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2。将PPI 网络分析数据从STRING 数据库中以TSV 格式导出，然后导入Cytoscape 3.2.1 软件中，绘制北豆根与UC靶点的PPI 网络图，见图3。

2.5 功能注释分析和功能富集分析结果 北豆根治疗UC 的“关键靶点”共在97 个（P＜0.01）GO term上富集，其中生物过程（BP）66 个，分子功能（CC）9个，细胞组成（MF）22 个。BP、CC、MF 的COUNT 得分排名前9 的分析结果如图4 所示，主要涉及的生物学功能与过程包括：细胞增殖与凋亡调控、信号传导、转录调控及药物反应等；北豆根治疗UC 的关键靶点共富集在62 条（P＜0.05）通路上，主要通过调控TNF、PI3K-Akt 、T 细胞受体等信号通路发挥作用，如图5所示。

3 讨论

本研究应用网络药理学方法对北豆根治疗UC的物质基础和作用机制进行研究。结果显示：从北豆根31 个已知化学成分中共筛选获得有效成分10个，北豆根和UC 的交集靶基因有44个，进一步探究了北豆根治疗UC 的生物学过程、分子功能和细胞组成，发现涉及的生物过程包括：炎症反应、免疫反应、RNA 聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控、转录的正向调节、细胞增殖正向调控、信号传导以及药物反应、细胞凋亡的负向调控、缺氧反应、NO 生物合成过程的正向调控等；分子功能包括：酶结合、蛋白结合、蛋白质同源二聚化活性、转录因子活性序列特异性DNA 结合、序列特异性DNA 结合、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子活性等，这些与UC 的发生和发展都有一定的联系。

PPI 网络分析结果显示IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2 等靶点是网络中的核心节点，推测它们是北豆根治疗UC的关键靶点。现代研究表明IL-6 在UC 的发病过程中起着重要的作用，它的过度表达会使肠上皮细胞通透性增加，促进巨噬细胞和中性白细胞的分泌、增殖、溢出并浸润至炎症部位，诱发或加重UC［9-12］。KEGG 通路富集分析发现62 条通路与UC 的发病相关，主要包括：TNF 通路、PI3K-Akt 通路、T 细胞受体信号通路等。研究显示：介导细胞的增殖、分化、凋亡和自噬的PI3K-Akt 信号通路［13］，活化后可上调肠黏膜p-Akt 表达［14］，激活核转录因子，上调TNF-α、IL-6等促炎因子的转录水平，诱发炎症，导致组织损伤［15］，同时研究表明UC 相关的癌变与过度活化的PI3K-Akt信号通路有密切联系［16-17］。

综上，北豆根可能通过IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2 等靶点调控调控TNF 通路、PI3K-Akt 通路、T细胞受体信号通路等通路，进而对消化、免疫等系统进行干预，抑制UC 炎症损伤。通过网络药理学的方法，不仅能有效阐明多成分中药的药理作用机制，还能揭示其作用靶点与关键信号通路，为中药药理和作用机制研究提供新的思路与方法，从而促进传统中药的应用。但是该方法也存在一定局限，其研究结论主要着眼于药材中的已知成分、靶点和通路，而容易忽略了可能存在的未知成分和非核心靶点和通路的作用；虽能预测发挥作用的靶点，但无法获知靶点的上调或下调，无法预测其功能改变的方向；同时也不能体现中药体内代谢产物对机制的影响。因此，需要进一步的体内外试验进行验证网络药理学的预测的结果，才能更加准确、客观地阐释中药的药理作用机制。

（本文图1～5见封三）