姜黄素通过上调miR-124减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤

简宇，范婷，代凌云，赵春虎

作者单位：长江大学附属荆州医院急诊科，湖北 荆州 434000

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是常见危重症呼吸系统疾病，主要以低氧血症和进行性呼吸窘迫为临床特征，病死率高达30%～45%［1-2］。其病因多样、发病机制复杂，目前尚未完全阐明，但研究表明，炎症反应在ALI 发生发展中发挥重要作用［3］。姜黄素（curcumin，Cur）是广泛存在于姜黄、莪术、郁金等中药根茎中的一种酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性，已有研究证实，Cur 可有效减轻脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导及脓毒症相关ALI，在肺部疾病中具有良好的应用前景，但其具体作用机制尚不清楚［4-5］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码小RNA，可通过对其靶基因转录后调控发挥生物学功能，其中miR-124 是一个重要炎症相关miRNA［6］，有研究报道，miR-124 可靶向抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）抑制下游核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）发挥抗炎作用［7-8］，但Cur 是否也通过该通路对ALI 大鼠发挥保护作用，尚未可知。因此本研究自2019 年9 月至2020 年5 月探究Cur 对LPS 诱导ALI大鼠的保护作用及对miR-124及其下游靶基因的表达影响，以期揭示其作用机制，为优化Cur临床应用提供进一步参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞 8 周龄健康雄性清洁级SD大鼠，体质量范围为290～310 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005，使用许可证号SYXK（沪）2017-0008。本研究符合动物伦理学标准。大鼠肺泡巨噬细胞NR8383来自ATCC细胞库。

1.2 主要试剂及仪器 Cur（货号HY-N0005，纯度96.31%）购自MCE 公司；LPS（货号L2630）购自Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，货号10099141）购自美国Gibco公司；RNA 提取试剂盒（货号R0011）购自上海碧云天有限公司；Prime-Script ™RT reagent Kit（Perfect Real Time）（货号RR037A）、microRNA 定量试剂盒（货号638315）、TB Green®Premix Ex Taq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（货号RR820A）购自TaKaRa 生物公司；脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000Reagent（货号11668）购自美国Invitrogen 公司；miR-124 模拟物及其阴性对照（miR-124 mimic/NC）、miR-124抑制剂及其阴性对照（miR-124 inhibitor/inhibitor-NC）及miR-124、U6、TRAF6、GAPDH引物均由广州锐博生物科技有限公司提供；大鼠TNF-α ELISA 试剂盒（货号ab236712）、IL-6 ELISA 试剂盒（货号ab234570）、兔源一抗anti-TRAF6（货号ab40675）、anti-β-actin（ab8227）、二抗羊抗兔IgG（货号ab6721）均购自英国Abcam 公司；MODEL550 型酶标仪购自美国Bio-Rad 公司；Forma Steri-Cycle i160 二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher 公司；ix75 荧光显微镜购自日本Olympus 公司等。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 NR8383 细胞常规复苏后采用含20%FBS、1%P/S Ham's F-12K 培养基置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，待细胞汇合至80%～90%时，用0.05%胰蛋白酶消化处理以1∶3 比例进行传代。

1.3.2 双荧光素酶报告基因实验 构建与miR-124种子区结合的TRAF6 基因3’UTR 野生型（Pmir-GLO-TRAF6-Wt）和突变型（Pmir-GLO-TRAF6-Mut）双荧光报告载体。构建PmiR-GLO-TRAF6 野生型和突变型重组载体后，采用脂质体转染法将miRNA（miR-124 mimic 或NC）和重组载体（野生型或突变型）共转染入NR8383 细胞中，于二氧化碳培养箱继续培养。每组设立5 个复孔，48 h 后用PLB 裂解细胞，收集细胞裂解液，离心后取上清检测萤火虫荧光素信号和海肾荧光素信号，以海肾荧光素酶活性为对照，计算其相对活性。

1.3.3 ALI 大鼠模型建立及分组 SD 大鼠采用随机数字表法分为对照组（NC 组）、LPS 组、LPS+Cur组、LPS+Cur+inhibitor-NC 组、LPS+Cur+inhibitor 组，每组10 只。LPS 组腹腔注射LPS 10 mg/kg 制备ALI大鼠模型［9］，LPS+Cur组在ALI模型制备30 min后尾静脉注射Cur 200 mg/kg，LPS+Cur+inhibitor-NC 组、LPS+Cur+inhibitor 组大鼠尾静脉分别注射miR-124 inhibitor-NC、miR-124 inhibitor 50 mg/kg 1 周后腹腔注射LPS 10 mg/kg，30 min 后尾静脉注射Cur 200 mg/kg，NC 组注射等量生理盐水30 min 后尾静脉注射等量生理盐水。24 h 后腹腔麻醉处死大鼠，分别采集心脏血及肺组织标本待检。

1.3.4 HE 染色观察肺组织病理学变化 取部分肺组织于4%多聚甲醛中固定，进行石蜡包埋，切片（4µm），苏木精-伊红（HE）染色，于光镜下观察肺组织病理学变化。

1.3.5 ELISA 检测血清TNF-α、IL-6 水平 常规分离血清，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.6 RT-qPCR 检测肺组织miR-124、TRAF6 mRNA 表达水平 采用RNA 提取试剂盒提取肺组织总RNA，浓度及纯度检测合格后，反转录得到cDNA，置于-20 ℃保存备用。采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）扩增miR-124、TRAF6 mRNA 目的片段。RT-qPCR 采用20µL反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 µL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4µL，cDNA（50µg/L）2 µL，上下游引物（10 µmol/L）各0.8 µL，ddH2O 6.0µL。反应条件为：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法对肺组织miR-124、TRAF6 mRNA相对表达水平进行定量分析。

1.3.7 蛋白质印迹（Western blotting）检测肺组织TRAF6 蛋白表达 采用蛋白抽提试剂盒提取肺组织总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，置于-80 ℃保存备用。取40 µg 蛋白样品，进行6%SDS-PAGE 电泳后PVDF 膜转膜，室温封闭，添加一抗（anti-TRAF6，稀释比1∶5 000；anti-β-actin，稀释比1∶1 000）4℃孵育过夜，洗膜后，添加二抗IgG（稀释比1∶5 000）室温孵育1.5 h，洗膜，显色，曝片，拍照，观察并分析蛋白条带灰度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。计量资料以±s 表示，两组比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，进一步任意两两比较采用SNK-q 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-124 可靶向TRAF6 基因表达 通过TargetScan、miRanda、miRTarBase 在线生物信息学软件预测TRAF6 基因3 'UTR 区可能包含miR-124 的互补序列（图1），提示TRAF6 可能是miR-124 的作用靶点。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染miR-124 mimic 和Pmir-GLO-TRAF6 野生型重组质粒NR8383细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而共转染miR-124 mimic 和Pmir-GLO-TRAF6 突变型重组质粒、转染miR-124 NC 和Pmir-GLO-TRAF6 野生及突变型重组质粒的NR8383 细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）（图2），提示miR-124可通过靶向TRAF6 3 ' UTR 区负调控其表达，二者存在直接靶向关系。

图1 TargetScan预测TRAF6 3'UTR中与miR-124结合序列

图2 NR8383细胞的相对荧光素酶活性

2.2 各组大鼠肺组织病理学变化 NC 组大鼠肺组织结构清晰，肺泡结构完整，无明显异常改变；LPS组、LPS+Cur+inhibitor 组大鼠肺组织结构破坏严重，肺间质增厚，大量炎性细胞浸润，弥漫性充血、渗出，肺泡萎缩；LPS+Cur 组、LPS+Cur+inhibitor-NC 组大鼠肺组织损伤减轻，见图3。

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6表达水平变化 与NC组比较，LPS组大鼠血清TNF-α、IL-6表达水平显著增加（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+Cur 组大鼠血清TNF-α、IL-6 表达水平显著降低（P＜0.05）；与LPS+Cur+inhibitor-NC组比较，LPS+Cur+inhibitor组大鼠血清TNF-α、IL-6 表达水平显著增加（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）表达水平变化/（ng/L，±s）

表1 各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）表达水平变化/（ng/L，±s）

注：①与NC 组比较，P＜0.05。②与LPS 组比较，P＜0.05。③与LPS+Cur+inhibitor-NC组比较，P＜0.05。

IL-6 5.49±1.06 32.74±2.27①21.44±2.12①②21.65±2.18①②28.97±2.29①②③262.99＜0.001组别NC组LPS组LPS+Cur组LPS+Cur+inhibitor-NC组LPS+Cur+inhibitor组F值P值鼠数10 10 10 10 10 TNF-α 6.14±1.21 45.28±4.85①29.26±2.72①②29.87±2.59①②34.59±3.02①②③212.52＜0.001

2.4 各组大鼠肺组织miR-124、TRAF6 mRNA 相对表达水平比较 与NC 组比较，LPS组大鼠肺组织miR-124 表达水平显著降低、TRAF6 mRNA 表达水平显著增加（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+Cur 组大鼠肺组织miR-124 表达水平显著增加、TRAF6 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；与LPS+Cur+inhibitor-NC 组比较，LPS+Cur+inhibitor 组大鼠肺组织miR-124 表达水平显著降低、TRAF6 mRNA 表达水平显著增加（P＜0.05），见表2。

2.5 各组大鼠肺组织TRAF6 蛋白表达量比较 与NC组比较，LPS组大鼠肺组织TRAF6蛋白表达量显著增加（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+Cur 组大鼠肺组织TRAF6蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；与LPS+Cur+inhibitor-NC 组比较，LPS Cur+inhibitor 组大鼠肺组织TRAF6 蛋白表达量显著增加（P＜0.05），见图4，表2。

图4 蛋白质印迹法检测各组大鼠肺组织TRAF6蛋白表达

表2 各组大鼠肺组织微小RNA-124（miR-124）与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）相对表达水平比较/±s

表2 各组大鼠肺组织微小RNA-124（miR-124）与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）相对表达水平比较/±s

注：①与NC 组比较，P＜0.05。②与LPS 组比较，P＜0.05。③与LPS+Cur+inhibitor-NC组比较，P＜0.05。

组别NC组LPS组LPS+Cur组LPS+Cur+inhibitor-NC组LPS+Cur+inhibitor组F值P值鼠数10 10 10 10 miR-124 1.01±0.09 0.37±0.04①0.74±0.06①②0.73±0.07①②TRAF6 mRNA 0.99±0.07 5.15±0.53①3.51±0.32①②3.56±0.34①②TRAF6蛋白0.11±0.01 1.07±0.10①0.38±0.04①②0.37±0.03①②10 0.48±0.04①②③4.67±0.41①②③0.45±0.04①②③447.11＜0.001 157.90＜0.001 192.86＜0.001

3 讨论

ALI 是外伤、感染、脓毒症等一系列刺激因素引起的复杂呼吸系统疾病，发病机制复杂，主要以肺内炎症反应失控导致的严重低氧血症、弥漫性肺损伤、肺水肿等为主要病理特征，伴随一系列基因表达失调等，但尚未完全明确［10］。目前临床尚缺乏ALI特效疗法，因此积极探究新型治疗方案，并深入研究其作用机制具有重要意义。肺泡巨噬细胞介导的固有免疫在ALI发生发展中发挥重要作用，LPS是革兰阴性菌细胞壁主要成分，是内毒素和重要群特异性抗原，LPS 感染机体刺激肺组织可活化肺泡巨噬细胞膜上Toll 样受体（TLRs），继而通过激活NF-κB诱导炎症级联反应，导致ALI发生［11-12］。本研究显示，LPS组大鼠肺组织出现严重损伤，肺间质增厚，大量炎性细胞浸润，弥漫性充血、渗出，肺泡萎缩，且血清促炎因子TNF-α、IL-6 表达水平显著增加，提示LPS 诱导ALI 模型成功。而Cur 可减轻ALI大鼠肺组织病理变化及TNF-α、IL-6 炎性因子分泌。Cur 是一种具有抗炎、抗氧化、抗血脂、抗肿瘤等多种功能的膳食多酚，研究表明，Cur 可通过上调线粒体融合蛋白2减轻脓毒症小鼠ALI［13］，还可通过抑制NF-κB信号通路减轻流感病毒感染引起的巨噬细胞活化和肺部炎症［14］，且对LPS 诱导的ALI 有显著治疗作用［15］，提示Cur 可减轻LPS 诱导的大鼠ALI，减轻肺组织炎症反应。

MiRNAs 在进化过程中高度保守，主要通过识别靶基因3'UTR 区抑制蛋白翻译或促进靶基因降解，在炎症调控反应中发挥重要作用。研究显示，MiR-124 在多种细胞中特异表达，是一种影响炎症通路的重要miRNA，与多种炎症性疾病密切相关［16-17］，miR-124 靶基因众多，本研究通过在线软件预测及文献检索发现，miR-124 可靶向抑制TRAF6表达发挥抗狼疮性肾炎［18］、ALI 肺泡巨噬细胞炎症［19］等作用，本研究经双荧光素酶报告基因实验结果显示，与其他对照组比较，共转染miR-124 mimic和Pmir-GLO-TRAF6 野生型重组质粒NR8383 细胞的荧光素酶活性显著降低，提示TRAF6 是miR-124的直接作用靶点。TRAF6 是TLR4 信号通路中关键蛋白，TRAF6 激活可进而引起TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子免疫应答，引发炎症级联反应，与肺损伤成正相关［20］。本研究结果显示，与NC 组比较，LPS组大鼠肺组织miR-124 表达水平显著降低，TRAF6 mRNA 及蛋白表达水平显著增加，而Cur 处理可显著增加miR-124 表达，抑制TRAF6 mRNA 及蛋白表达，提示Cur 可能通过促进miR-124 表达抑制TRAF6 表达，减轻LPS 诱导的ALI 大鼠肺组织炎症反应，发挥治疗作用。为进一步验证上述结果，本研究在LPS+Cur 基础上转染miR-124 inhibitor，结果显示，与转染miR-124 inhibitor-NC 对照比较，转染miR-124 inhibitor 可显著降低Cur 治疗效果，进一步验证Cur 可通过miR-124/TRAF6 轴发挥作用，但可能不是唯一途径，具体相关通路有待进一步深入研究。

综上所述，Cur 可通过上调miR-124 靶向抑制TRAF6 减轻LPS 诱导的大鼠ALI 及炎症反应，发挥治疗作用。但是否存在其他信号通路参与，及具体作用机制有待进一步深入探究。

（本文图3见插图8-2）