奶牛源G10P［11］型A群轮状病毒的分离鉴定

卜 娴，汤 承，岳 华

（西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

牛A群轮状病毒（Bovine Rotavirus A，BRVA）在犊牛腹泻中占有重要地位，是引起犊牛腹泻的主要病原之一，2 月龄以内犊牛最易感，呈世界性流行［1-2］。BRVA 是一种分节段的双链RNA 病毒，为呼肠弧病毒科轮状病毒属成员，病毒子直径为60～80 nm［3］。BRVA 基因组大小约为18 kb，含有11 个基因节段，编码6 个结构蛋白（VP1～VP4、VP6、VP7）和6 个非结构蛋白（NSP1～NSP6）［4］。轮状病毒有多种基因型，通常用GxP［x］表示，其中G 型和P型分别是由VP7和VP4基因序列决定的［5］。研究显示，BRVA至少有14种G型和14种P型，我国发现的BRVA 基因型有G6、G8、G10 和P［1］、P［5］、P［11］，G 型和P 型可组合成不同的基因型，这让BRVA 基因型变得更为复杂。不同基因型毒株之间的交叉免疫保护效果差。因此，了解我国牛群中BRVA 的流行情况及基因型，对BRVA感染的防治至关重要。

1 材料与方法

1.1 临床样本及材料 7份BRVA阳性犊牛腹泻粪便样本来自四川某奶牛场，MA-104 传代细胞系、兔抗BRVA 阳性血清由西南民族大学动物医学实验室提供；TrizolTMReagent 购于TaKaRa 公司；反转录试剂盒购于成都市蓉为基因生物科技有限公司。

1.2 病毒的分离 按照文献［6］报道的方法，将BRVA 阳性粪便样本接种到MA-104进行病毒的分离培养，观察细胞病变。

1.3 病毒的鉴定

1.3.1 RT-PCR 鉴定 采用周芳等［7］建立的方法对分离株进行BRVA特异性RT-PCR检测。采用文献［8-9］报道的分型引物分别去扩增分离株的VP7、VP4基因片段，PCR产物送北京擎科生物科技有限公司测序，并用轮状病毒分型软件ViPR鉴定分离株的G、P基因型。

1.3.2 间接免疫荧光鉴定 以兔抗BRVA阳性血清为一抗，按照文献［6］报道的方法对分离株进行间接免疫荧光鉴定。

1.3.3 电镜观察 将分离株的培养物在4 ℃条件下以1 000 r∕min 离心10 min，收集上清液，送至成都里来医学实验中心进行透射电镜观察。

2 结果

2.1 病毒培养情况 7 份阳性样本盲传至第3代，其中有1份出现细胞病变，至第6代细胞病变趋于稳定，接种后24 h 开始出现细胞病变，可见细胞聚集、脱落、拉网等现象（图1）。

图1 分离株引起的细胞病变图（10×40）

2.2 病毒的鉴定

2.2.1 RT-PCR 鉴定 对分离株的1～6 代培养物进行BRVA 特异性RT-PCR 检测，从中扩增出约231 bp 的条带（图2），测序结果经BLAST 比对后证实为BRVA 的特异片段，说明分离株为BRVA。

图2 分离株RT-PCR检测结果

2.2.2 分离株的基因型 分离株经分型鉴定，确定为G10P［11］型。

2.2.3 间接免疫荧光鉴定结果 间接免疫荧光鉴定结果显示，感染细胞胞浆中可见明亮的绿色荧光（图3），说明该分离株可与BRVA 抗体发生特异性反应，证明分离株为BRVA。

图3 分离株间接免疫荧光鉴定（10×40）

2.2.4 分离株的形态 电镜观察可见直径为60～80 nm的圆形病毒颗粒，呈典型的“车轮状”，符合轮状病毒的形态特征（图4）。

图4 分离株病毒子的形态（透射电镜，150 000×）

综上可见，本研究成功分离出1 株致细胞病变稳定的奶牛源G10P［11］型BRVA。

3 讨论

本研究分离到1株致细胞病变稳定的奶牛源G10P［11］型BRVA毒株，为其遗传进化和免疫防治等方面的研究提供了材料。我国牛群中存在G6P［1］、G6P［5］、G6P［5］P［11］、G8P［1］、G10G6P［5］、G10P［11］型等多种基因型BRVA毒株感染，优势基因型为G6P［1］和G6P［5］［10-12］。目前，BRVA 的防控措施主要为疫苗免疫［13-14］，而分离得到BRVA毒株对疫苗的研发至关重要。尽管我国已有关于G6P［1］、G6P［5］、G6P［11］、G8P［1］和G10P［11］型BRVA 毒株的分离报道［6，15-20］，但是G10P［11］型BRVA作为国内的一个流行毒株，对其的分离鉴定报道并不多。常继涛等人从11份BRVA阳性犊牛腹泻样本中分离出1株致细胞病变稳定的奶牛源G10P［11］型BRVA毒株［18］；谢金鑫从10份BRVA阳性犊牛腹泻样本中分离出1株致细胞病变稳定的奶牛源G10P［11］型BRVA毒株，并对其基因组特征进行了研究［19］。有关G10P［11］型BRVA毒株的基本生物学特性、致病性及与其他基因型毒株的交叉保护等方面的研究尚未见报道。■