干细胞生长因子对胰腺癌细胞生长、迁移及神经浸润的影响

尚万兵，吴文斌

(1.新乡医学院 a.法学院；b.基础医学院，河南 新乡 453003；2.新乡医学院司法鉴定中心，河南 新乡 453003)

胰腺癌是临床常见的恶性消化系统肿瘤类型之一，其发病率和死亡率相当，预后差，患者5 a总生存率为5%，接受根除术治疗后患者的5 a生存率也低于20%，若不接受临床治疗，患者的生存期约4个月[1-2]。近年来，随着临床治疗手段的不断完善，胰腺癌的治疗方案(尤其是手术治疗)取得了较大突破，但胰腺癌患者的预后仍不理想[3]。神经浸润是指肿瘤细胞在相关分子生物学机制下侵犯神经的现象[4-5]，目前已经发现胰腺癌、直肠癌、胃癌等都存在神经浸润现象[6-8]，同时也是胰腺癌预后差的主要原因之一。胰腺癌发生神经浸润概率可高达80%，但胰腺癌神经浸润的分子机制目前仍未完全阐明。干细胞生长因子(stem cell growth factors，SCF)是一种多效性细胞因子，可通过与c-kit受体(酪氨酸激酶受体)结合介导细胞迁移、细胞外基质黏附以及调节因子分泌，可参与多种生理过程[9-10]。前期研究发现SCF因子在胰腺癌细胞中表达显著升高，但其与胰腺癌细胞的生物学功能的关系目前尚不清楚。本研究通过构建SCF过表达胰腺癌细胞系以分析SCF对胰腺癌细胞生长、迁移及神经浸润的影响。

1 一般资料

1.1 实验材料和仪器裸鼠(6～8周)购自上海斯莱克生物有限公司；人胰腺癌PANC-1、AsPC-1和正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7购自美国ATCC公司；SCF慢病毒由山东维真生物科技有限公司构建、生产并浓缩；总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自德国QIAGEN公司；2×SYBR Green qPCR Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；cDNA反转录试剂盒购自日本TAKARA公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Invitrogen公司；兔抗人SCF兔多克隆抗体购自美国Abcam公司；β-actin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔二抗购自北京中山金桥生物技术有限公司；CCK-8检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems公司；荧光显微镜和光学显微镜购自日本奥林巴斯；CO2细胞培养箱、酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 SCF过表达稳定细胞系的构建将指数生长期的胰腺癌PANC-1细胞、AsPC-1细胞置于2.5 g·L-1胰酶中消化，接种细胞至6孔板(10 000个/孔)，细胞贴壁后，将PANC-1细胞分为对照组1和过表达组1，AsPC-1细胞分为对照组2和过表达组2，并分别向培养液中加入100 μL病毒溶液、SCF过表达病毒溶液，感染48 h，结束后嘌呤霉素处理，杀死未感染的细胞，存活的细胞即为稳定细胞系，采用荧光定量PCR和免疫印迹试验(Western blot)鉴定细胞中SCFmRNA和蛋白质表达情况。

1.3 荧光定量PCR分析SCFmRNA表达各组细胞系和HPDE6-C7细胞生长至指数生长期，收集细胞1×106个/每个样，离心细胞弃上清，细胞沉淀采用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用反转录试剂盒反转录为cDNA，测定浓度备用。根据SCF基因序列设计如下引物：SCF-F为5’- AGGCAAGGTT TTCTACAGCATCAC-3’；SCF-R为5’-TAGTCTTTTGGAAGATTTGCC-3’。将合成的引物浓度稀释为10 μmol·L-1，并对其特异性进行分析。PCR反应体系(20 μL)：2×SYBR Green Mix 10 μL、SCF-F/R各0.6 μL、cDNA 8.8 μL。将上述所配混合物加入荧光定量PCR板，上荧光定量PCR仪检测，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，循环数40个，PCR结束后建立溶解曲线，并在仪器上直接读数，分析两组mRNA水平。

1.4 Western blot分析SCF的表达水平提取各组细胞系和HPDE6-C7细胞离心后细胞沉淀总蛋白，100 g·L-1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，50 g·L-1脱脂奶粉封闭1 h，50 g·L-1的脱脂奶粉稀释兔抗人SCF抗体(1∶500)在4 ℃孵育12 h，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min，羊抗兔HRP标记的二抗(1∶2 500)室温孵育1 h，PBS洗涤3次后，增强型化学发光液处理，收集影像，观察蛋白表达，以β-actin作为内参。

1.5 MTT测定胰腺癌细胞的增殖能力将对照组1和过表达组1、对照组2和过表达组2细胞系培养至指数生长期，用2.5 g·L-1胰酶消化后，细胞密度调整为1×105个·mL-1，接种100 μL细胞悬液于96孔板，预培养12 h，使细胞贴壁，分别继续培养6、12、24、48 h时，吸干培养液，每孔加入100 μL MTT溶液，继续孵育3 h，酶标仪测定在572 nm的吸光值，绘制增殖曲线。

1.6 Transwell分析胰腺癌细胞侵袭能力用50 mg·L-1Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干，吸出培养板中残余液体，备用。将对照组1和过表达组1、对照组2和过表达组2细胞系培养至指数生长期，用2.5 g·L-1胰酶消化后，细胞密度调整为1×106个·mL-1，取细胞悬液200 μL加入Transwell小室，常规培养12～48 h，体积分数为40 g·L-1多聚甲醛固定，1 g·L-1结晶紫染色，显微镜下观察单个视野细胞侵袭数目。

1.7 神经浸润小鼠模型的构建24只6～8周龄去胸腺裸鼠分为对照组和过表达组，采用异氟烷麻醉，暴露出其左侧坐骨神经，分离肱二头肌，采用显微注射的方法分别将SCF过表达胰腺癌PANC-1细胞系、对照细胞系注入过表达组、对照组裸鼠坐骨神经的神经束膜，每只细胞水平为1×105个，体积为10 μL，建立坐骨神经浸润模型。注射后6周处死小鼠，免疫组化分析神经浸润情况。

1.8 免疫组化分析神经浸润情况小鼠在建模6周后，麻醉处死小鼠，切取坐骨神经和肿瘤组织石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡3次，每次10 min，依次放入梯度无水乙醇中水化，按试剂盒说明步骤进行NF-200免疫组织化学染色。

2 结果

2.1 SCF稳定细胞系构建情况分析结果如图1所示，对照组1胰腺癌细胞系SCFmRNA表达(0.98±0.16)、蛋白表达(0.41±0.09)均低于过表达组1(4.32±0.78、2.18±0.37)(P<0.05)；对照组2胰腺癌细胞系SCFmRNA表达(1.01±0.12)、蛋白表达(0.48±0.10)均低于过表达组2(4.85±0.51、2.58±0.31)(P<0.05)；正常胰腺细胞中SCFmRNA表达(0.36±0.08)、蛋白表达(0.15±0.05)均低于对照组1、对照组2(P<0.05)。

A为荧光定量PCR电泳结果；B为SCF mRNA表达；C为SCF蛋白表达条带；D为SCF蛋白表达；与对照组1比较，*P<0.05；与对照组2比较，#P<0.05。

2.2 SCF对胰腺癌细胞增殖的影响结果如图2所示，与对照组1比较，过表达组1各个不同时间点的增殖能力增加(P=0.011)；与对照组2比较，过表达组2各个不同时间点的增殖能力增加(P=0.007)。

与对照组1比较，*P<0.05；与对照组2比较，#P<0.05。

2.3 SCF对胰腺癌侵袭能力影响结果如图3所示，过表达组1细胞侵袭数目(85.41±12.19)高于对照组1(28.90±4.99)(P=0.001)，过表达组2细胞侵袭数目(93.28±10.95)高于对照组2(34.11±6.51)(P=0.001)。

A为结晶紫染色(100×)；B为细胞侵袭数目；与对照组1比较，*P<0.05；与对照组2比较，#P<0.05。

2.4 SCF对胰腺癌细胞神经浸润能力的影响结果如图4所示，在建立胰腺癌模型后6周，对照组12只小鼠4只出现了坐骨神经功能障碍(33.33%)，过表达组12只小鼠10只出现了坐骨神经障碍(83.33%)，其中4只完全瘫痪，两组比较，差异具有统计学意义(χ2=6.171，P=0.013)；免疫组化结果显示NF-200阳性表达升高。

图4 SCF对胰腺癌细胞神经浸润能力的影响

3 讨论

胰腺癌是起源于胰腺导管上皮、腺泡细胞的临床上常见消化道难治性肿瘤，其发病具有隐匿特点，早期诊断较为困难，且该疾病进展迅速，导致胰腺癌患者的生存时间短，预后较差[11]。因此，胰腺癌也是病死率最高的肿瘤类型之一，位居全球前十位。胰腺癌的发病病因尚未完全阐明，目前普遍认为其发病与多种因素有关，例如癌前病变、基因异常和遗传等因素，同时不良的饮食习惯、肥胖、长期吸烟和胰腺慢性损伤是诱发胰腺癌发病的重要影响因素[12]。胰腺癌的发病、进展机制是目前科学研究者和临床医生关注的热点和难点。

SCF定位于人12号染色体q22～q24区域，编码248个氨基酸。SCF通过与其受体c-Kit结合，可激活下游信号转导分子，从而调节一些重要的基因转录[13]。目前已有研究显示，C-KIT基因表达异常可刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控，进而促进细胞的恶性增殖，目前已经在胃肠道间质瘤、白血病、肺癌、结肠癌以及胰腺癌中观察到C-KIT基因的异常表达[14-17]。本课题的前期研究表明，SCF在胰腺癌细胞中呈现高表达状态，其主要可能通过c-kit激活，诱导胰腺癌的恶化。Kuai等[18]研究显示，SCF参与胃癌细胞增殖调节过程，本研究为进一步探讨SCF在胰腺癌中可能发挥的作用，体外构建SCF稳定过表达胰腺癌PANC-1细胞系和AsPC-1细胞系，并通过基因表达、蛋白表达实验验证稳定表达细胞系构建成功，同时还发现正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中SCFmRNA、蛋白质表达均低于胰腺癌细胞。胰腺癌病情进展迅速、患者预后差与恶性肿瘤细胞不受限的细胞增殖、细胞侵染能力强等因素有密切关系，本研究发现SCF过表达PANC-1、AsPC-1细胞系的增殖活性较其阴性对照细胞系呈现出增长趋势，说明SCF过表达可促进胰腺癌细胞增殖活力，也间接说明SCF在胰腺癌细胞增殖过程中扮演着重要的角色。

胰腺癌难治的原因众多，其中包括癌细胞增殖迅速、容易转移等。目前，普遍认为神经浸润是恶性肿瘤细胞沿着神经生长，或者是在神经鞘的内膜、神经束膜、神经外膜的层面有肿瘤细胞的现象，是导致胰腺癌术后复发、难治和病死率高的主要原因。目前对于神经浸润的机制存在不同的观点，这些观点包括低阻力通道学说、癌细胞神经相互作用学说以及神经重塑和再生学说，虽然上述各种学说在一定程度上解释神经浸润特点，但还是无法完全阐明胰腺癌神经高发的主要机制。肿瘤细胞的侵袭能力能够反映细胞转移浸润的特性，本研究发现SCF过表达PANC-1、AsPC-1细胞系的细胞侵袭数目高于其阴性对照细胞系，有研究发现SCF对间充质干细胞的迁移有促进作用[19]，还有研究表明c-Kit与SCF结合可提高上皮性的卵巢癌中干细胞存活率[20]，本研究结果也呈现出相似趋势，说明SCF过表达可以增强胰腺癌细胞的侵袭能力，同时也提示SCF可能参与胰腺癌肿瘤的神经浸润。为证实这一假设，本研究构建坐骨神经浸润模型，并将SCF过表达细胞系和对照细胞系注射进入坐骨神经周围，发现SCF过表达组裸鼠坐骨神经障碍发生率为83.33%，阴性对照组裸鼠坐骨神经障碍发生率为33.33%，两组裸鼠坐骨神经障碍发生率比较，差异有统计学意义，同时免疫组化结果显示SCF过表达组裸鼠NF-200阳性表达升高，阴性对照组裸鼠的NF-200阳性表达很低，说明SCF过表达可以增强胰腺癌的神经浸润能力，并在胰腺癌神经浸润过程中发挥着重要作用。

综上所述，SCF表达升高可以增强胰腺癌细胞增殖和侵袭能力，促进胰腺癌神经浸润的发生，但其中SCF是通过何种作用机制促进胰腺癌细胞增殖、侵袭以及神经浸润情况，还需从生物学分子层面开展研究。