日粮添加牡丹籽油改善SD大鼠生育能力的作用研究

霍鹏，曹俊娜，李曼，姚军*，张顺*

（1.桂林医学院公共卫生学院，广西 桂林 541199；2.桂林医学院附属医院生殖医学中心，广西 桂林 541001）

0 引言

牡丹属毛茛科芍药属多年生灌木植物，油用牡丹种类更是我国独有的土生土长的木本油料作物，牡丹籽不但产油量高，而且不饱和脂肪酸含量非常丰富，尤其是n-3PUFAs的中的ALA，其含量高达42%。N-3PUFAs是一类人体必须的脂肪酸，主要包括α-亚麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，不能由动物自身合成，必须通过外源摄取。N-3PUFAs作用广泛，可增强青少年视力、促进大脑发育、抗癌、抗炎、减肥等作用[1]，近年来其在生殖健康领域的研究也方兴未艾[2]。ALA作为n-3PUFAs家族的重要一种，在雄性的精液质量方面的作用被相继报道，研究显示在家兔饲粮中添加富含ALA的日粮可通过改变精子脂质组成改善精子质量[3]；饲喂富含ALA的亚麻籽可以在体内通过碳链的延长显著增加公牛精子DHA 的含量，而且也可以改善精子冷冻和解冻后损伤和质膜的组成成分，提高解冻后精液的质量[4]。此外，饲粮中添加亚麻籽油可改善蛋鸡的精液品质、生殖激素及与睾酮合成相关的基因和蛋白表达[5]。但是牡丹籽油作为含ALA最为丰富的油脂资源之一，其在雄性生殖方面的研究尚未见报道，本研究拟通过构建不育大鼠模型，探讨牡丹籽油在改善大鼠模型精液质量以及生育力方面的效用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

体重约250-280g的健康SD雄鼠290只（6周龄），SD雌鼠100只，置于温度(24±1)℃、湿度(60±5)℃，12小时明暗交替环境适应性饲养1周。饲料为SPF级大鼠饲料，垫料为实验动物专用玉米芯垫料，使用前经高压蒸汽灭菌。

1.2 主要药品试剂

白消安、二甲基亚砜（DMSO）等购自Sigma 公司；受精液等购自深圳妙泉仪器设备有限公司，牡丹籽油购自称山西潞安石圪节智华生物科技有限公司。取200mg白消安粉末溶于20mLDMSO溶液中，完全溶解后，将浓度为10mg/mL的白消安分装于1.5mL Eppendorf 离心管中，4℃避光保存备用，注射前将该浓储液用灭菌生理盐水1：9稀释（1mg/mL）用于注射。

1.3 方法

1.3.1 不育雄性大鼠模型构建与鉴定

连续10天按4mg/kg的剂量白消安每日注射SD大鼠腹腔，累计注射剂量40 mg/kg，以SD大鼠连续注射第10天为模型第0 d（D0）。于注射后D30采集精液。阴性对照组腹腔注射等量DMSO+生理盐水。注射结束后取30只大鼠脱臼处死检查精液质量，首先将睾丸挤入腹腔，腹部皮肤消毒，于腹中线开口，取出附睾，从附睾尾部挤出乳白色精子团，将精子移入1 mL受精液中，二氧化碳培养箱中培养5-10 min，吹打混匀，进行精子计数。取10μL精液，置于精子计数板上，静置1-2min钟显微镜下观察；精子畸形检查参照苏木精-伊红染色法。

1.3.2 添加牡丹籽油饲料饲喂

将上述鉴定成功的雄性不育SD大鼠模型随机分为两组，对照组(常规日粮)、实验组(常规日粮+20%牡丹籽油)，喂养12周后进行下一步实验。

1.3.3 精液质量检测及生育力检查

精液检查同1.3.1；睾丸组织切片步骤为：脱颈椎处死后取睾丸组织，将模型组、牡丹籽油饲喂组以及阴性对照组睾丸取出后切开鞘膜，4%福尔马林分装固定。经过脱水、包埋、切片，以苏木精-伊红染色制片，显微镜观察各组睾丸组织并摄片。余SD不育大鼠模型及对照组与雌性SD大鼠1:1合笼，观察雄鼠爬背情况，次日早检查阴道栓，可见阴道栓者初步判为交配成功，统计产仔情况。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(±s)表示，比较采用t检验；计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。。

2 结果

2.1 雄性不育SD大鼠模型的构建与鉴定

白消安注射构建模型D30进行精液检查，结果如表1所示，与对照组相比，模型组精液在精子密度、精子活力、前向运动精子比例以及精子畸形率上均显著下降，鉴定结果显示连续10次注射白消安大鼠腹腔，可成功构建精液质量明显下降的雄性不育大鼠模型。

表1 白消安注射构建模型D30大鼠的精液情况(±s)

表1 白消安注射构建模型D30大鼠的精液情况(±s)

注：列内具不同上标的值差异有统计学意义a，b，P<0.05.

组别 鼠数 精子密度 精子活力 A+B级精子 精子畸形率模型组 10 7.14±1. 31a 31.45±4. 23a 7.22±1. 46a 97.24±2.56a对照组 10 51.11±2.25b 63.49±2.13 b 32.53±3.42b 85.78±3. 77b

2.2 饲喂牡丹籽油日粮对雄性不育大鼠模型精液质量的影响

（1）不育大鼠模型分别经常规日粮和添加20%比例牡丹籽油的日粮饲喂12周后，精液质量如表2所示，精子密度、精子活力、前向运动精子比例以及正常精子比例，牡丹籽油组均显著高于常规日粮组，精子形态学检查如图1。结果表明牡丹籽油能够显著改善不育大鼠模型的精子质量。

图1 精子形态学检查

表2 常规日粮和添加牡丹籽油日粮饲喂后精子质量情况(±s)

表2 常规日粮和添加牡丹籽油日粮饲喂后精子质量情况(±s)

注：列内具不同上标的值差异有统计学意义a，b，P<0.05.

组别 鼠数 精子密度 精子活力 A+B级精子 精子畸形率模型组 25 13.16±2. 38a 36.21±2. 21a 11.28±1. 47a 94.24±2.56a牡丹籽油组 25 34.92±2.25b 51.42±3.43 b 27.51±3.65b 87.72±3. 43b

（2）饲喂牡丹籽油日粮对雄性不育大鼠模型睾丸组织形态的影响

不育模型组整个睾丸组织严重萎缩，极度退化变性，精曲小管萎缩变细疏松，管腔内各级生精细胞呈明显的空泡化，基底膜侧精原细胞偶见，精曲小管内未见精子；间质组织发生退化，细胞形态不完整，排列紊乱，总体表现基本丧失生精能力（图2）。饲喂含有牡丹籽油的日粮后，可见大部分的精曲小管恢复2-4层生精上皮细胞，基底膜侧可见散在精原细胞，整体表现仍为精子生成能力低下（图3），组织形态学表现与附睾精子质量检测结果一致，但是与对照组相比，生精能力仅为部分恢复（图4）。

图2 模型组睾丸形态学

图3 对照组睾丸形态学

（3）饲喂牡丹籽油日粮对雄性不育大鼠模型对生育力的影响

将每只不育模型SD雄鼠单独饲养，按1：1的比例与雌鼠合笼，观察雄鼠爬背情况，次日早检查阴道栓，见阴道栓者初步判为交配成功；产仔时，统计产仔率。结果如表5所示，与常规日粮组相比，牡丹籽油组的雄鼠的爬背发生率、见栓率以及产仔率上均显著升高，而与未做任何处理的阴性对照组相比，仍显著低于阴性对照组，以上结果表明牡丹籽油能在一定程度上改善雄性不育大鼠的生育力。

3 讨论

3.1 牡丹籽油对雄性不育大鼠精液质量的改善

近年来，由于受生育年龄推迟、环境改变、压力增大、生育意愿低等原因，人口出生比例严重下降已经是一个不可回避的社会问题，统计显示约有15%左右的育龄期夫妇存在着生育障碍，其中男性因素引起的比例占约40%，最新的男性精液质量调查报告显示，男性精子质量仍然有下降的趋势[6]，虽然男性精液质量下降可以通过辅助生殖手段解决生育需求，但是科学技术总是存在两面性，辅助生殖技术毕竟还是一个未经过历史长期检验的技术，在子代的表观遗传、畸形率、并发症的长期观测上还缺乏足够相应的数据支持[7]，因此，自然生育仍然是获得子代的首选方式。

许多研究都表明n-3多不饱和脂肪酸对雄性动物的精液有着显著的提高作用，主要聚焦在DHA和EPA等长链n-3PUFAs的探讨上，因为他们不仅是影响精子活力的精子质膜的重要组成部分，而且有较强的抗氧化能力，因此在日粮中添加富含长链n-3PUFAs日粮中，可显著改善猪、牛等动物的精子活力、顶体完整性、精液量；降低畸形精子率和顶体异常比例；提高解冻后精液品质，甚至于调控相关基因诱导精子的发生[8,9]。但是短链n-3PUFAs对精液质量的探讨较少，目前主要聚焦在亚麻籽及亚麻籽油对雄性生育能力的影响，研究显示富含ALA的亚麻籽及亚麻籽油也能能显著改善家畜的繁殖性能。牡丹籽油同样作为含有ALA最为丰富的植物油脂之一，进行雄性生育力影响的实验研究亦有着独特的优势，在本研究中结果显示牡丹籽油确实提高了大鼠模型的精液质量，包括提升了精液密度，增强了精子活力，降低了畸形率，以上结果表明牡丹籽油对精子的发生和成熟有明显的促进作用，这和同样作为ALA主要来源的亚麻籽油在动物上的研究结果相似。因此牡丹籽油作为雄性动物的n-3PUFAs的补充剂对于提高生育力及繁殖性能也有着同等重要的应用潜力。

3.2 牡丹籽油对雄性不育大鼠模型生育力的改善

日粮中添加n-3PUFA 可提高多种雄性动物的繁殖力，但是上述研究主要采用以富含长链n-3多不饱和脂肪酸的鱼油为主要载体，而对于短链n-3多不饱和脂肪酸与雄性生育力的相关性研究不多见。通过人体内的同位素追踪技术，发现摄入的ALA有高达21%的转化成EPA，有9%转化成了DHA，转化效率较为可观[10]，因此饲喂富含ALA的日粮对促进雄性动物的生育力改善也有着充分的理论依据。文献报道，在日粮添加了亚麻籽油的雄性动物中发现，可以显著提高大鼠的血清睾酮水平，睾酮对维持睾丸生精功能起着至关重要的作用[11]，这一点与本研究中牡丹籽油促进生精小管的有着相同的结局，此外随着日粮中亚麻籽油的比例增高，其体内的前列腺素也在增加，有研究表明前列腺素可直接刺激睾丸间质细胞分泌睾酮，进一步增加睾丸体积、精子数量以及提高精子的活动能力。

本研究结果不仅从精液层面验证了牡丹籽油对精液质量的改善作用，而且在形态组织学上进行了验证，通过睾丸组织的免疫组化结果表明，牡丹籽油显著改善了不育大鼠的生精功能。但是，虽然在牡丹籽油的毒理学检测中，结果显示牡丹籽油对精子质量没有促进作用[12]，但是我们认为因其实验设计的剂量和饲喂时间的区别，从而导致与本研究结果存在一定的出入，但是不存在相驳的结论，在另一项牡丹籽油对环磷酰胺致小鼠遗传毒性和肝损伤的保护作用研究中，结果显示日粮添加牡丹籽油确实提高了精液的质量[13]。通过生育力检测发现，牡丹籽油饲喂的不育SD大鼠模型的生育力得到了显著的恢复，结果同文献报道的饲喂长链n-3PUFAs的研究结果相一致，而且与亚麻籽油的结果相一致。

综上所述，通过成功构建雄性不育大鼠模型，进行添加牡丹籽油的日粮饲喂，经检测发现牡丹籽油不但能提高雄性不育大鼠的精液质量，而且能够部分恢复其生育功能，结果表明牡丹籽油确能有改善雄性生育能力的作用。