25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位点多态性与深圳地区妊娠期糖尿病易感性分析

杨秋娥，潘婷，梁红梅，罗裕旋，凌晟荣，钟文英

（深圳市龙华区妇幼保健院，广东 深圳 518109）

0 引言

妊 娠 期 糖 尿 病（gestational diabetesmellitus，GDM）是指孕前糖代谢正常妇女于妊娠期间发生或首次出现糖尿病或不同程度糖耐量异常或空腹血糖升高，其病因及发病机制目前尚未完全明确，有研究表明，GDM是由环境、遗传及生活方式等多种因素共同所致的一种复杂性疾病[1-3]。维生素D（Vitamin D，VitD）主要调节钙、磷代谢，此外还参与糖脂代谢、胰岛素合成和分泌、炎性、免疫及肿瘤的发生和发展过程，与多种疾病的发生有密切关系[4-6]。VitD受体（vitamin D receptor，VDR）含有25-（OH）D-1α羟化酶，可使VitD转化为具有活性的25-(OH)VitD3，且VDR基因多个位点易发生多态性突变，进而影响VitD的水平或结构，从而参与多种疾病发生[7-8]。本文对深圳区域GDM和妊娠期非糖尿病患者血清25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位点多态性进行对比研究分析，了解25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位点多态性与深圳地区GDM的易感性，现报导如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2021年01月至2021年06月深圳市龙华区妇幼保健院妇产科门诊及住院部确诊GDM患者76例为GDM组。GDM诊断符合《中国2型糖尿病指南（2020年）》[9]中的诊断标准：24～28周口服75 g葡萄糖行OGTT试验，空腹血糖≥5.1 mmol/L，服糖后1 h血糖≥10.0 mmol/L，2 h≥8.5 mmol/L，其中有一个值达到标准即可诊断GDM。选择同期在我院妇产科门诊及住院部就诊的妊娠期非糖尿病患者80例为对照组。纳入标准：①单胎妊娠；②无肝、肾、心及产科其它并发症；③患者及家属签署知情同意书；④经医院伦理委员会批准同意。排除标准：①显性糖尿病（妊娠期）；②孕前糖尿病；③合并慢肺阻、哮喘、慢性消化性和泌尿系统疾病；④伴有恶性肿瘤者；⑤有糖尿病家属史者；⑥服用VitD及其他钙制剂者；⑦伴有甲状腺疾病者。确保两组孕妇年龄、孕中期BMI及分娩孕周比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 仪器与试剂

iflash3000-C化学发光分析仪（深圳亚辉龙）；DNA 提取试剂盒（深圳亚能）；ABI7500仪（美国ABI公司）；基因SNP多态性分析试剂盒（上海吉凯）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

均于清晨抽取空腹外周静脉血5.0~6.0mL，其中2.0~3.0mL于干燥管内，离心(3500r/min)10min，取血清测定25-(OH)VitD3水平。余下的于EDTA-K2抗凝管内，用于VDR基因rs731236T/C位点多态性分析。

1.3.2 25-(OH)VitD3水平测定

采用化学发光免疫法检测血清25-(OH)VitD3水平，按试剂和仪器说明书进行操作。

1.3.3 VDR基因rs731236

T/C位点SNP分析 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法对VDR基因rs731236 T/C位点SNP进行分析。具体方法：（1）DNA提 取；（2）引物设计上游引物：5’-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3’，下游引物：5’-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTC TC-3’；（3）PCR反应体系：反应总体积25.0μL，含模板DNA 2 ng，引物10 nmol，聚合酶1 U，dNTPs5 nmol；（4）扩增条件：95℃预变性10 min，然后以95℃30 s，65℃30 s，72℃延伸60 s，循环35次，最后72℃延伸7min；（5）酶切：取扩增产物4μL，加5 U Apa I酶，10xBuffer TangoTM 2μL，加ddH2O至20ul，37℃水浴消化1 h；（6）多态性分析：取酶切产物于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验比较；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验比较；遗传平衡采用Hardy-Weinberg检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组25-(OH)VitD3水平比较

GDM患者血清25-(OH)VitD3水平为（24.93±7.61）mmol/L，明显低于对照组的（50.27±14.38）mmol/L，两者差异有统计学意义（t=5.0645，P<0.05）。

2.2 Hardy-Weinberg检验

GDM组和对照组VDR基因rs731236 T/C位点SNP均检出TT，TC和CC 3种基因型。经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，差异无统计学意义（χ2=1.2048，P>0.05），表明抽样具有代表性。

2.3 两组VDR基因rs731236

T/C位点SNP比较 GDM患者VDR基因rs731236 T/C位点CC基因型及C等位基因检出率分别为48.68%和59.21%，明显高于对照组的21.25%和33.13%，差异有统计学意义（χ2=5.8172，4.0721，P<0.05），结果见表1。

表1 GDM组和对照组VDR基因rs731236 T/C位点SNP比较[n（%）]

2.4 不同基因型GDM患者25-(OH)VitD3水平比较

VDR基因rs731236 T/C位点CC基因型GDM患 者 血 清25-(OH)VitD3水 平 为（13.29±4.58）mmol/L，明显低于TC和TT基因型的（33.70±6.85）mmol/L和（37.55±8.27）mmol/L，差异有统计学意义（t=6.9125，7.2854，P<0.05），但TC和TT基 因型GDM患者25-(OH)VitD3水平差异无统计学意义（t=1.3028，P>0.05）。

3 讨论

GDM是妊娠期间首次发生的糖耐量异常综合征，可导致多种妊娠不良结局。此外，其还增加产妇及新生儿日后患2型糖尿病（T2DM）和心血管疾病风险，并能引起一系列并发症及后遗症，严重影响产妇及新生儿生活质量，对母婴健康造成巨大威胁，且随着我国经济和生活水平不断提高、肥胖率及高龄产妇比例不断增加，其发病率呈逐年上升趋势[10-12]。但GDM病因及发病机制目前尚未完全明确，给GDM患者早发现、早诊断及预防带来很大困难。因此，探索GDM病因及发病机制，对预防、诊断及治疗GDM具有重要的临床意义。

VitD主要调节钙磷代谢，但最近研究表明，妊娠期孕妇体内VitD缺乏或不足与一系列不良妊娠结局有密切关系[13-14]。而25-(OH)VitD3是VitD主要存在形式，其水平可直接反映人体内VitD储存水平，且与VitD缺乏的临床症状相关，同时不同地区和种族人群之间存在差异很大[15-17]。本研究结果显示，深圳地区GDM患者血清25-(OH)VitD3水平较妊娠期非糖尿病孕妇明显降低（P<0.05），与有关报导基本一致[15-17]，这表明25-(OH)VitD3水平降低可能是导致GDM的发病的危险因素之一。

研究表明，GDM可能由多种因素共同所致的，其中遗传在其发病中发挥着重要的作用，但有关遗传病因和发病机制尚未完全清楚。随着全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）不断深入研究发现，GDM发生和发展与人体内多个基因多个位点多态性突变有关[18-19]，其中VDR基因多个位点（如是TaqⅠ、FokⅠ、BsmⅠ和ApaⅠ）的多态性突变与GDM发病有关，如张琰等[20]报导辽沈地区汉族女性人群中VDR基因ApaⅠ位点多态性与妊娠期糖尿病存在相关性，但不同地区和种族人群因遗传背景、环境、免疫及生活习惯等诸多因素的不同而基因多态性存在地域性和种族性差异。本研究结果显示，深圳地区GDM患者VDR基因rs731236 T/C位点CC基因型和C等位基因频率明显比妊娠期非糖尿病孕妇升高（P<0.05），这表明VDR基因rs731236 T/C位点多态性可能与GDM的发病有密切关系，其中CC基因型可能是本地区GDM发病的危险易感基因之一。此外，携带VDR基因rs731236 T/C位点CC基因型的GDM患者血清25-(OH)VitD3水平明显比妊娠期非糖尿病患者降低（P<0.05），这说明VDR基因rs731236 T/C位点多态性可能通过影响25-(OH)VitD3水平或结构而在GDM发病中发挥作用的。

综上所述，深圳区域GDM患者25-(OH)VitD3含量显著降低，其中CC基因型GDM患者降低尤为明显，且VDR基因rs731236 T/C位点呈多态性分布。因此，加强孕妇25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位点多态性分析，对GDM患者早期诊断、治疗及发病机制研究具有重要的意义。