狼疮性肾炎患者树突细胞B7-H4表达与调节性T淋巴细胞的相关性研究

肖长长 罗丹 陈少英 胡志辉 刘兰霞 骆九源 苏小玲 张俊爱

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是自身免疫介导的,以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病。其特征是自身抗体产生的抗核和/或细胞质抗原增加,免疫复合物沉积在各个器官的微血管中,补体激活和整合,白细胞在多个器官中浸润,以及各种类型的组织损伤［1-3］。50%～70%的SLE患者病程中会出现临床肾脏受累,肾活检显示几乎所有SLE均有肾脏病理学改变。LN对SLE预后影响甚大,肾功能衰竭是SLE的主要死亡原因之一［4］。B淋巴细胞和T淋巴细胞都参与狼疮发病［5］。目前临床上仍以激素联合免疫抑制剂为主要的治疗方案,但其治疗有显著的副作用,且仍有部分患者对传统的方案不敏感,这类患者极易发展为多器官功能衰竭、终末期肾脏病［6］。因此,深入研究LN的发病免疫机制,寻找理想的LN治疗靶点具有重要意义。B7-H4是最近发现的B7家族新成员,属共抑制分子,在正常组织中及细胞中有大量信使核糖核酸(mRNA)表达,但是蛋白质水平的表达较低,而在肿瘤细胞中,B7-H4 在mRNA 水平以及蛋白水平中均高表达,可以通过抑制T细胞增殖和细胞因子分泌对T细胞的免疫应答进行负性调控［7］。树突状细胞(dendriticcell,DC)是参与固有免疫、启动和调节适应性免疫最重要的细胞之一,是唯一能活化Naive T细胞的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)。最近研究证明,DC在LN中起着关键作用［8］。B7-H4介导的信号途径对T、B细胞活化起负调节作用,可在DC细胞上诱导性表达,其作用及机制尚不明确。CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs) 最先是因其控制自身抗原的免疫反应能力而被识别的,它保持自身免疫稳定和防止自身免疫发生,Liu等［9］发现CD4+CD25+CD127lo可以替代CD4+CD25+Foxp3+表达。据此作者推测,在抗原及炎症因子长期刺激下,B7-H4分子被耗竭,B7-H4+DC细胞下调,B7-H4+DC细胞促进NaiveT细胞向Tregs的分化减少,Tregs减少导致LN持续炎症反应过强。本项目中检测B7-H4在外周血DC中的表达,分析B7-H4+DC与Tregs的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020年5～12月在本院肾内风湿免疫科门诊及住院确诊的LN患者50例作为实验组,所有病例均符合1997年美国风湿病学会(ARA) 修订的LN诊断标准,同时排除合并严重感染和患有肿瘤的患者,其中男5例,女45例；年龄22～46岁,平均年龄(34.2±12.3)岁。根据患者的SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)评估结果分为活动期组(SLE疾病活动指数积分≥10分,30例)和静止期组(SLE疾病活动指数积分＜9分,20例)。经治疗目前无临床症状或有微量蛋白尿,但无进展,实验室检查无显著异常,抗ds-DNA抗体转阴或抗核抗体滴度很低。另选择同期在本院健康体检者45例作为健康对照组,其中男5例,女40例；年龄24～46岁,平均年龄(34.5±10.5)岁。实验组和健康对照组的性别和年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。健康对照组纳入标准：既往无系统性红斑狼疮及严重慢性疾病病史,近期无使用糖皮质激素,血常规、肝肾功能、免疫相关指标正常。本研究经东莞市厚街医院的批准,并征得研究对象的知情同意,实验在广东医科大学免疫实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 FITC标记CD4、PE标记CD25、Alexa Fluor标记CD127。上述试剂盒及CBA试剂盒、淋巴分离液、Buffer液等均购自美国BD公司；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪型号为BD公司产品。

1.2.2 实验方法 检测B7-H4+DC细胞及Treg,采集患者和健康对照组外周血,采用密度梯度离心获外周血单个核细胞(PBMC),然后采用流式细胞术检测DC中B7-H4表达情况及Tregs的数量。CD4+CD25+CD127loT细胞的检测具体操作详见参考文献［10,11］。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验,多组比较采用方差分析；定性计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；相关性分析采用非参数Spearman分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血DC中B7-H4表达情况比较 活动期组外周血DC中B7-H4表达水平低于健康对照组,差异具有统计学意义(P＜0.01)；静止期组外周血DC中B7-H4表达水平与健康对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组外周血DC中B7-H4表达情况比较(n)

2.2 活动期组B7-H4表达与CD4+CD25+CD127loT细胞数量的相关性分析 经Spearman相关性分析,狼疮活动期组B7-H4表达水平与CD4+CD25+CD127loT细胞数量呈正相关(r=0.611,P＜0.05)。见表2。

表2 狼疮活动期组B7-H4、CD4+CD25+CD127lo T细胞的相关性(n)

3 讨论

B7-H4又名B7S1,B7x,是新近发现的B7新家族成员,属共抑制分子。其mRNA在外周组织中分布广泛,但其蛋白质仅在造血细胞表面呈诱导性表达,主要表达于抗原提呈细胞和活化的T细胞表面。B7-H4在外周组织细胞中介导的免疫应答中起负调节作用,其所介导的信号途径可抑制T细胞的增殖和白细胞介素(IL)-2的分泌,阻滞T细胞的细胞周期,还可抑制中性粒细胞前体细胞的功能［12］。有研究［13］发现,B7-H4抗原表达于肾小管上皮细胞胞浆中,LN患者B7-H4 阳性肾小管数明显低于对照人群,并且和肾脏组织中的肾小管间质损害积分明显负相关。LN患者sB7-H4含量与正常对照和无肾炎的 SLE 患者无明显差异,但其和SLE-DAI明显正相关,LN高度活动组明显高于中度活动组。同时有实验表明,B7-H4缺乏症也加剧了LN小鼠模型淋巴组织肿胀和肾脏病变［14］。用B7-H4拮抗剂抗体治疗也加重了狼疮模型,相反,B7-H4 Ig减轻了狼疮的表现［15］。这些证据均表明B7-H4在LN的发病过程中起着重要的作用。

DC主要参与机体的免疫功能,在LN中起着关键作用。B7-H4介导的过程对T、B细胞主要是起负性调节,可在DC细胞上诱导性表达。DC在LN发展和进步中的作用：目前尚不确定LN中免疫应答和免疫耐受平衡是如何被打破的,但DCs被认为在LN中起着关键作用［16］。①LN患者血清、淋巴结和炎症组织(如皮肤和肾脏)中发现高水平的凋亡细胞,这些调亡细胞的自身RNA和DNA与pDCs的Toll样受体第9型(TLR9)或Toll样受体第7型(TLR7)［17,18］的结合,诱导Ⅰ型干扰素(IFN)的持续输出。DCs产生的IFN以自分泌的方式促进自身的活化和成熟,包括IFN的输出增加,CD80、CD86和MHCⅡ类的表面表达增加,使其更善于激活T细胞。DC细胞功能异常：HN患者中 pDC刺激T细胞的能力明显增强。②同时发现LN患者 pDCs在加入凋亡的PMNs后没能诱导出调节性T调节的细胞特征(Foxp3表达),而健康者能诱导表达FoxP3。③SLE供体的未成熟DC和成熟DC均表达较高水平的CCR7、CD40和CD86,并诱导较强的T细胞增殖；系统性红斑狼疮患者DCs的异常行为是由内在缺陷引起的,是由其在炎症环境中的发展引起的,还是两者的结合引起的目前尚不清楚。基于SLE中观察到的DCs功能的失调以及DCs在SLE发病机制的启动和持续中的作用的新证据,深入探讨DC在LN发病中作用及其机制,对探寻LN治疗的靶点具有重要意义。

调节性T细胞又名抑制性T细胞,是一群具有免疫调节功能的T细胞亚群,可通过负向调节其他免疫细胞的功能进行维持自身免疫稳态。其不但维持自身和外来抗原的免疫耐受,在自身免疫学疾病、肿瘤、感染性疾病［19］等也发挥重要作用。调节性T细胞可分泌多种抑制性细胞因子如IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)、IL-35等,还下调APC细胞的功能或竞争APC细胞上的共刺激分子进行抑制效应性T细胞［20］。调节性T细胞是CD4+T细胞的一个亚群,通过抑制自身反应性淋巴细胞维持自我耐受；具有免疫抑制功能,其数量的减少和功能的减弱可能参与了LN的发生,因此,调节性T细胞的缺陷或缺乏调节性T细胞被认为是SLE发病机制的一部分［14］。Liu等［9］研究发现CD4+CD25+CD127lo可以替代CD4+CD25+Foxp3+表达。

B7-H4在自身免疫性疾病中发挥了重要作用,最新研究发现狼疮鼠敲除B7-H4基因或使用抗B7-H4抗体封闭内源性B7-H4表达后出现大量抗dsDNA 抗体产生、肾脏病变进展,然而使用B7-H4Ig可以减轻狼疮样症状。据此作者推测,在抗原及炎症因子长期刺激下,B7-H4分子被耗竭,B7-H4+DC细胞下调,B7-H4+DC细胞促进Naive T细胞向Tregs的分化减少,Tregs减少导致LN持续炎症反应过强。

本研究发现,活动期组外周血DC中B7-H4表达水平低于健康对照组,差异具有统计学意义(P＜0.01)；静止期组外周血DC中B7-H4表达水平与健康对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。经Spearman相关性分析,狼疮活动期组B7-H4表达水平与CD4+CD25+CD127loT细胞数量呈正相关(r=0.611,P＜0.05)。这一结果与郑京等［21］的研究是一致的。B细胞的激活有两条主要途径：①经典激活途径：T细胞辅助B细胞产生自身抗体；②在无T细胞的辅助下,DC通过和B细胞的受体相结合,使得B细胞活化。B细胞的异常活化,自身免疫耐受性降低,直接针对自体抗原产生大量的自身抗体,造成器官和组织的损伤,构成了系统性红斑狼疮的发病基础。作者推测,狼疮活动期组患者B细胞活化,在此发病基础上,CD4+T细胞、CD4+CD25+CD127loT细胞凋亡增多,因此循环的CD4+CD25+CD127loT细胞绝对数量也减少。因此,临床工作中,可通过干预DCs或提高Tregs的水平治疗和改善LN患者的病程。

综上所述,B7-H4在活动期LN患者外周血中低表达,而且与调节性T细胞数量呈正相关,可作为狼疮活动性的指标,可能成为LN了解其免疫状态、生物靶点治疗的重要依据。