研究烟草烟雾提取物对人牙龈成纤维细胞增值的影响

陈嘉彤 金鼎 杜旸 王雪松

吸烟的人群常常面临许多困扰,人们生活中常见的例如：口腔异味、牙面烟斑烟渍等。然而现代研究明确证实,吸烟后口腔清洁不净产生的烟斑可加重牙周疾病。吸烟也会促进口腔中白色念珠菌从芽孢到菌丝形态的转变,从而加重口腔念珠菌病的程度［1］。吸烟量与口腔白斑的关系紧密,是口腔癌发病的高危因素。中国疾控中心也发布过,婴幼儿4个月暴露于二手烟环境中,会增加龋齿患病的风险。另外,吸烟对婴幼儿唇腭裂的发生、吸烟者龋病的发病、种植牙能否长期成功等问题都有紧密的联系［2-4］。有一些研究也证实,有长期吸烟史的患者比无吸烟史者更易有口腔科的相关疾病［5,6］。每支香烟经过燃烧可产生上千余种化合物,而口腔是人体众多器官中最早接触到烟草烟雾的,从前大多数研究报告中报道过尼古丁对HGF有不利影响,而在此次实验研究中作者保全完整的烟草烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE),充分检测其中的完整成分进行实验。此次通过体外传代培育人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF),并用CSE作用于细胞上,从而观察烟草烟雾对HGF增殖的影响。通过观察CSE影响HGF传代增殖讨论CSE对于牙周病愈合过程中产生的不利影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 烟草(盒式香烟)；DMSO(二甲基亚砜,Sigma公司)；四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT,Sigma 公司)；胎牛血清(FBS,杭州四季青公司)；胰蛋白酶(Gibco)；抗波形丝蛋白和抗角蛋白抗体(迈新公司,河南),CO2细胞培养箱(Heraeus公司,德国)；酶联免疫检测仪(Spectra Ⅲ,奥地利)；倒置显微镜(Olympus,日本)；人骨保护蛋白酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海瑞齐生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 组织块法原代培养HGF［7］收集健康成人因种植修复牙龈成形术弃除的健康无炎症牙龈组织,分成大小约1 mm的组织块,并用含胎牛血清(FBS)的DMEM确保组织块不干燥,取得的牙龈组织块单层铺于25 ml大小的细胞培养瓶中,随后将其翻转加入含15%FBS的培养基10 ml,置5%浓度CO2细胞培养箱中保持37℃约2 h,翻转培养瓶接着培养［8］。每间隔5 d察看牙龈成纤维细胞繁育状况。若细胞生长后次日更换培养基,细胞繁育达瓶底一半后可加入0.25%的胰酶进行消散,显微镜下发现若HGF由长梭形转变成圆球状时,马上弃除胰蛋白酶,重新加含15%FBS的培养基继续培育,当细胞覆盖瓶底3/5后再进行第1次传代,当细胞形成单层后再次传代(为1∶2)。

1.2.2 HGF形态观察 HGF培养到第5天,显微镜下可见：有少许长梭形细胞由组织块周围放射状离散出来,渐渐成晕状。牙龈成纤维细胞呈现长梭形或者放射星形,细胞胞浆丰满,有2～4个不等的胞浆突,细胞核大多为一个且为椭圆形,细胞紧贴培养瓶壁爬行生长。细胞较少密度低时细胞间呈网状,细胞密度高时则排成旋涡状或者呈束(见图1)。

图1 HGF细胞形态(×100)

1.2.3 传代细胞来源鉴定 选取第4代培养细胞至于载玻片上作为细胞的来源鉴定,采用丙酮溶液固定,吹干,用进行抗波形丝蛋白(1∶100)及细胞抗角蛋白(1∶100)免疫组化染色。显示抗波形丝蛋白染色阳性,抗细胞角蛋白染色阴性,从而判定传代的细胞来自中胚层(图2,图3)。

图2 抗角蛋白阴性表达(×400)

图3 抗波形蛋白阳性表达(×400)

1.2.4 CSE 依据Oltmanm方法,燃烧一根香烟,过滤嘴的一侧运用纤维过滤器连接到橡胶导管上,导管的另一侧接含10 ml培养基的有塞试管,同时在试管塞接50 ml注射器抽吸CSE,8次,50 ml/次,用时30 s,随后去除过滤端。将总400 ml烟雾试管放置2 h,用浓度1 mol/L的氢氧化钠将其酸碱值调至中性,用纤维滤膜过滤从而得到纯的烟雾提取物原液,将原液按照2.5%、5.0%、10.0%、20.0%的浓度比例稀释成实验用液,并在0.5 h内应用于本实验。

1.2.5 CSE对HGF增殖的影响 用第5代的健康细胞,含3×104/ml的细胞培养基接种于各96孔板内,各组8孔共计5组,100 μl/孔。细胞培养箱中用含15%胎牛血清培养基培养24 h后,再更换为10%FBS的培养液,加入稀释成不同浓度梯度的CSE,使其最终浓度依次为2.5%、5.0%、10.0%、20.0%,空白对照。培养5 d后,每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl,4 h后终止培养,移弃孔内液体,加入150 μl二甲基亚砜,振荡溶解结晶物15 min,酶联免疫仪检测490 nm的OD值。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,两组比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

作用24、48、72 h时,空白对照、2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均逐渐降低,且2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均低于空白对照,差异具有统计学意义 (P＜0.05)。见表1。

表1 CSE对HGF增殖的影响()

表1 CSE对HGF增殖的影响()

注：与空白对照比较,aP＜0.05

3 讨论

本实验结果显示：HGF被不同浓度(2.5%、5.0%、10.0%、20.0%)CSE的培养液作用,其细胞增殖受到明显抑制,空白对照、2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均逐渐降低,且2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均低于空白对照,差异具有统计学意义 (P＜0.05),且细胞增殖的抑制作用随CSE浓度的升高明显增强。当CSE浓度达到20.0%以上时,实验受到CSE中色素成分的干扰无法准确进行。但实验中证实,CSE能够抑制HGF的增殖,抑制了骨保护蛋白的表达,从而影响HGF的数目甚至功能。

Tipton等［9］曾经提出过,烟草中的尼古丁可以明显的使HGF增殖受到抑制,当尼古丁的浓度达到0.05%的时候,会抑制细胞产生纤维连接蛋白以及Ⅰ型胶原；烟冷凝物能够通过影响金属基质蛋白酶从而增加HGF中Ⅰ型胶原的降解［10］；Eduardo等［11］提出烟草中的有害成分可阻止HGF对无病变牙根以及玻璃的粘附；烟草燃烧产物里面的有害物通过对细胞的附着、增殖、分泌等过程产生干预［12］；Cattaneo等［13］研究认为,燃烧的烟草会散发出丙稀等物质,通过影响细胞的附着和增殖抑制其在体外培养的过程。β1-integrin是HGF粘附因子之一,暴露于香烟烟雾中会抑制β1整合素的产生从而影响牙龈成纤维细胞的粘附［14］。高浓度的烟草冷凝物还会通过抑制细胞白介素6和8的分泌从而改变牙龈成纤维细胞生长周期,抑制其生长［15］。本实验与上述研究结果一致,可能是由于CSE会通过影响HFG生长使其失去粘附力；HGF的细胞蛋白质合成能力减弱；进而影响牙龈细胞的附着；并且HGF对胶原纤维束的调节能力遭到破坏,给外界有害侵犯物质以可乘之机；通过使底物表面产生电荷变化,从而使HGF的粘附得到干扰；细胞自身吞噬功能减弱,使得不良的胶原纤维不能有效的被排出,牙周支持织不能及时有效恢复,说明了吸烟不但使牙周病继续进展［16］,更不利于牙周治疗,不利于治疗创伤的恢复［17］,提示其在牙周病病理中的作用。

研究表明,吸烟可能通过对牙龈胶原纤维及牙龈成纤维细胞产生的损伤,使牙齿周围支持组织的自我修复能力减弱。吸烟也可以通过促进牙周袋内壁上皮细胞产生过角化,从而阻止结合上皮的重新附着,使牙周袋更深;牙周支持组织部分血供减少,进而使得自身修复力及防御力均降低［18］。总结过去他人和本次的研究发现,烟草烟雾提取液对牙周病病情的发生、发展产生了十分重要的影响,本实验中高浓度CSE对HGF增殖起到显著的抑制作用。因此,烟草与牙周病的相关作用的具体机制仍需进一步研究。