药物血脑屏障通透性体外模型及评价方法的研究进展

程刚 郑金红 李国臣 刘阳 张华妮 曹贤达 殷莉

随着人口老龄化的趋势及快节奏生活方式的改变,诸如精神分裂症、抑郁症、阿尔茨海默症、帕金森氏症、脑卒中等中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病发病率呈逐年上升态势,严重威胁着人们生命健康和生活质量,已成为医药领域及社会各界都高度关注的焦点。但血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)功能性滤过机制使得几乎全部大分子和98%的小分子物质难以从血液进入脑组织［1］。BBB的这种低通透性是药物渗透进入CNS的主要限速因素［2］,给CNS疾病的治疗带来了严峻的挑战。由于传统动物模型种属差异与影响因素的多重性(如实时药物稳态的血药浓度、给药途径、剂型、剂量、药物在脑内代谢情况及与血浆蛋白结合状态等),导致各药物穿透BBB的参数差异很大,无法实现真实模拟人体BBB的目的。所以,研究人员亟需建立能准确预测和评价药物在体内穿透BBB能力的高仿真体外模型,以此为载体促进CNS药物的筛查。本文对BBB的生理结构及功能、体外细胞模型的构建以及药物BBB通透性评价方法等方面的研究进展进行阐述,以期能为后续穿透BBB的靶向制剂开发提供参考。

1 BBB的生理学基础

BBB的相关研究已有近百年历史,得益于现代生物膜理论与神经生理学科的迅速发展,极大加深了人们对这一机能现象的再认识。BBB系一层介于外周血液与脑、脊髓神经元细胞之间的动态界面,其低通透性、高选择性阻碍能力对维护CNS的稳态至为关键。BBB主要结构可分为三部分：最内层为脑毛细血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)及其之间的紧密连接(tight junction,TJ)；中间层为基膜(basement membrane,BM)和周细胞(Pericyte)；外层为星形胶质细胞(Astrocyte)和细胞外基质。解剖生理结构见图1［3］,其各主要结构的功能特点见表1。

表1 BBB主要结构的功能特点

图1 BBB解剖生理图

BBB的屏障效应除了受其机械结构和物理电荷的影响也与功能方面息息相关。在BBB上与毛细血管结合的高活性神经肽降解酶(胺肽酶、内肽酶、血管紧张素转化酶等)组成的“酶化屏障”可进一步限制特异性物质的转运。如治疗CNS疾病的药物常因其代谢基团与神经肽耦联时,受到“酶化屏障”的干扰使得不稳定而影响疗效。此外,BBB还存在着“免疫屏障”,即BMECs上大量与免疫调节相关的内源性受体及转运系统［7］,如转铁蛋白受体单克隆抗体(OX26)、葡萄糖转运蛋白、胰岛素受体、P-糖蛋白(P-gp,又称MDR逆转剂)［9］及多药耐药相关蛋白(MRP)等。这些转运受体通过吸收周围循环系统中的营养物质(如氨基酸、己糖、维生素、胆碱、低密度脂蛋白、神经肽及核酸等)并克隆出对应的特异性抗体,若在主动脑靶向递药系统中能利用该克隆抗体作为药物前体,将对CNS新药研发大有裨益。另外,小胶质细胞(Microglia)和Astrocyte分别充当脑内巨噬细胞与抗原递呈细胞参与免疫反应［10］。

2 BBB体外模型的建立

2.1 单层BMECs模型 建立单层内皮细胞模型的核心在于脑微血管的分离和获取的BMECs纯性。常采取机械分散或胶原酶消化及密度梯度离心法将脑微血管与其他杂质细胞(如周皮细胞、成纤维细胞等)分离,降低污染程度。一般多使用牛脑微血管内皮细胞(BBMVEC)和猪脑微血管内皮细胞(PBMVEC)进行原代培养,但这些大型动物细胞因为取材难度较大也会用大鼠脑内皮细胞替代培养。尽管各研究者培养的单层BMECs模型在相差显微镜下存在部分形态学差别,但在超微结构与细胞特征性抗原表达上仍表现出较好的一致性,保持了BBB典型的转运蛋白和酶的表达。如可对体内激素和生理刺激产生反应,保证血管的完整性和张力；表达外周血管内皮细胞膜标志物Ⅷ因子相关抗原(vWF)；与植物血凝素特异性结合,吸收低密度脂蛋白等［11］。而由于单层细胞模型的分离、培养方法较繁琐、纯化不够以及离体培养的BMECs忽略了真实在体BBB微环境,通常表现出紧密连接的通透性增高、低至中等的跨膜电阻值(TEER)、特异性酶和功能性蛋白表达减弱等特征。这种重要特性丧失的“表型漂移”(Phenotypic drift)现象随细胞培养的传代而加重,往往因缺失关键的BBB结构蛋白表达,不能充分发挥其屏障功能［12］,因此单独用内皮细胞构建BBB模型有其自身的局限性。

2.2 BMECs与Astrocyte共培养模型 实践证明将BEMCs与Astrocyte共培养可以克服单层细胞模型中的“表型漂移”,保留住BBB完整特性来更好地模拟BEMCs的微环境。该模型借助Transwell系统将BEMCs接种在上室,Astrocyte接种在微孔膜下方或小室底壁,多室微孔膜(0.4 μm)使得两种细胞彼此间隙2～3 nm,既能透过各种小分子及生长因子相互作用而又阻止细胞直接接触［13］。不过Astrocyte诱导BEMCs增强屏障特性的机制尚未完全阐明,学界普遍认为可能与其分泌的活性细胞因子有关,如胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)诱导细胞极性的产生使胞间紧密连接更严实［14］。在实践中多以BEMCs同种属和原代培养的Astrocyte共培养的表现型最为接近在体状态［15］,形成的转运体和酶的表达更具活性。陈雪等［16］使用大鼠原代BEMCs和Astrocyte在Transwell小室中建立共培养BBB模型,用免疫荧光检测各细胞特征标记物并观察跨内皮细胞电阻TEER的动态变化。研究显示：共培养生长后的原代BEMCs具有典型的梭形“铺路石”样形态,内皮细胞间形成紧密连接,而Astrocyte则表现出多个突起的典型外观；免疫组化鉴定BEMCs和Astrocyte分别表达vWF抗原与神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP),且细胞纯度均达到95%以上；共培养BBB模型的TEER为(65±1.42)Ω·cm2较单独BEMCs培养模型显著升高,以上表明通过共培养融合使模型结构更具真实模拟在体BBB特性的能力。於晓东等［17］利用小鼠BEMCs和Astrocyte建立共培养BBB模型,进一步研究来源于非小细胞肺癌A549细胞的外泌体对其功能的影响。分别于共培养24、48、72 h后进行TEER检测及48 h辣根过氧化物酶渗透试验,结果显示共培养48 h及72 h后接种外泌体实验组TEER较对照组明显降低(P＜0.01),表明人非小细胞肺癌细胞外泌体可使BBB通透性增加。

2.3 三维BBB模型 为了最大限度地模拟在体BBB微环境,目前,有研究者［18,19］构建出BMECs-周细胞-Astrocyte或神经元等在同一Transwell中培养出三维BBB模型,充分发挥细胞间的相互作用。三维培养模型中一些BBB大分子标记物(如Claudin-1、Claudin-3、Claudin-5、Claudin-12、ZO-1及ZO-2)在mRNA水平和蛋白水平表达量均不同程度上调,同时跨膜电阻明显增强,渗透率降低,结构与体内环境最相似［20］,具有较高的研究价值。曲园［8］将人体原代BMECs-周细胞-Astrocyte在低粘附琼脂糖凝胶培养板内建立新一代3D-BBB体外模型,分别采用细胞示踪技术和免疫荧光染色技术,对模型内细胞分布及模型表面具有的功能蛋白(如紧密连接和P-gp等)进行鉴定,证实该模型内细胞排列及表征与人体内BBB结构高度拟合,特异性蛋白表达量远高于传统模型。

2.4 动态BBB模型 随着研究表明,血流剪切力会对BEMCs的分化和信号转导会产生影响,从而改变其屏障能力。近年来出现的微流控芯片BBB模型发展十分迅速,在体内BEMCs与胶质细胞的相互作用暴露于血流的剪切作用力之下,将生化信息和几何性综合起来,更好地模拟体内组织的动态,并可实时监控分子转运迁移［21］。微流体BBB代表最现实的体外系统来研究血流动力学变化和诱导炎症是如何影响大脑微血管的完整性。通过引入改性后具有较大透孔的中空纤维,既能克服模型不允许免疫细胞的跨内皮迁移的问题,而不损害系统的模仿阻隔性的能力。实践中可通过对血流进行干扰等方式降低切应力模拟BBB损害状态,可以极大地促进内皮细胞-白细胞相互作用(释放活性氧和细胞因子)及各种导致免疫细胞外渗进入脑基质的研究。微流体BBB可广泛应用于各种CNS疾病的分子病理学研究如脑缺血再灌注损伤和癫痫等改变。Cucullo等［22］利用中空纤维技术设计出具有体外BBB人性化动态的毛细管系统(DIV-BBB),即在三维流动环境中使BEMCs与Astrocyte共同培养发育,形成一个功能性BBB。1周后,通过对14C-蔗糖、TEER及乳酸生产/葡萄糖消耗率等通透性功能测定,证明了此模型良好的再现了一个体内有氧代谢模式下的生理环境。

2.5 永生型细胞株模型 鉴于原代BEMCs的分离、纯化技术繁琐且难以定期获取等不足,而永生型细胞株表型比较稳定、易传代和大量增殖的特点恰是复制BBB体外模型理想的材料。目前开发最普遍的永生细胞系有hCMEC/D3、大鼠RBE4、小鼠bEnd.3等,而尤以大鼠脑内皮细胞系RBE4建立的模型最具代表性。虽永生细胞有望克服不同转运子的底物和抑制剂的重复交叉影响［23］,但RBE4往往不能形成紧密连接结构,不具备限制小分子通透的性能,导致该模型不适用于渗透性的研究［24］。hCMEC/D3细胞系则会表达具有连接性的结构蛋白,主要作用于BBB物质转运机制的研究。另外,人多能干细胞(human placental stem cells,hPSC)可通过诱导分化提供可再生、可持续的脑内皮细胞,很好地复制出相关转运蛋白和屏障性能［25］,在干细胞治疗脑系疾病研究中前景深远。

3 药物BBB通透性评价方法

3.1 体内评价 药物BBB通透性的体内评价主要指测定脑血比lg(Cbr/Cbl),即计算稳态下的药物透过BBB的量与血液中的化合物浓度的比值,常有脑组织匀浆法、微透析法等技术方法［26］。原梅等［27］建立大鼠稳态脑分布模型后,LC-MS/MS定量分析安替比林、阿替洛尔和ZZB系列新药候选化合物的血浆和脑组织药物浓度,测出安替比林、阿替洛尔的脑血比KP值与Caco-2细胞跨膜表观渗透系数Papp值均符合已知透脑性质,表明测定稳态药物脑血比适用于药物BBB通透程度的评价。脑组织匀浆法优势在于样品采集操作性高、提取量大,可对微量成分进行浓缩测定,但采集的脑组织样品并非来自活体动物,因此并不完全真实。

脑微透析则结合灌流取样和透析技术以此实现连续在线监测活体脑内完整细胞外液物质动态变化。叶勇等［28］经大鼠鼻腔或静脉注射给予芎冰喷雾剂后,利用微透析技术进行脑内药动学研究,HPLC法测定透析液样品中磷酸川芎嗪(TMPP)的浓度,经鼻和静注给药后TMPP都能快速进入脑内达到峰浓度,且吸收均符合一室模型,经鼻给药TMPP在脑内保留时间更长。表明微透析法能实现芎冰喷雾剂鼻腔给药后TMPP的药动学研究。此法可多次多部分同时取样,取样量少对体内平衡干扰小,保持稳定生理状态。不可避免的是脑部探针的埋植对脑组织有一定损伤,而且透析结果只能反映特定时间范围内突触间隙的递质浓度变化,还要考虑透析膜回收率对测定数据的影响。

3.2 体外评价 由于BBB的生理结构复杂使得体内评价受限于多种因素影响(如实时药物稳态的血药浓度、给药途径、剂型、剂量、药物在脑内代谢分布及与血浆蛋白结合状态等),而通过临床直接考察药物跨BBB更不现实。因此,药物BBB通透性评价更多是借助高效简便的体外细胞模型来完成。理想的体外模型在研究BBB的生理病理改变、物质转运机制、信号传导及筛选潜在脑靶向药物方面优势显著。体外评价的关键要素不仅应考察模型的细胞形态、TEER、内皮渗透系数、紧密连接(如Claudin、Occludin、ZO-1和ZO-2等特异性蛋白)等生理结构和基本参数,还要具备诸如葡萄糖转运子、胰岛素受体、转铁蛋白受体及外排泵(如P-gp及MRP)等功能性转运体的表达作用。另外,良好的模型更要从药物体内外代谢与活体BBB的相关性进行分析,同时兼顾模型的简单性、实用性和可及性。常见BBB模型体内外相关性的检测见表2［29］。

表2 BBB模型标记物与检测方法

张水华等［30］采用大鼠原代BCEC细胞与Astrocyte建立体外BBB模型并评价药物渗透能力。非接触式培养后可见到典型的细胞形态(短梭形BCEC细胞和分枝状突起Astrocyte)；免疫组化分别检测出高表达因子Ⅷ抗原和胶质纤维酸性蛋白,TEER及荧光素钠的通透性符合建模要求；LC-MS检测西咪替丁等6个化合物体内外透过BBB模型渗透系数具有一定相关性(R2=0.7679)。查雨锋等［31］则建立大鼠脑微血管内皮细胞与周细胞、Astrocyte三重培养体外BBB模型,各细胞均呈现出典型形态(BMECs铺石路样、BMPC胞体较大且呈分枝状,AS细长突触)；TEER及荧光素钠渗透系数及对碱性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰转肽酶1(γ-GT1)的表达测定满足模型要求；测定计算出阿替洛尔等5个阳性药通过BBB模型的渗透量Papp与已知体内数据具有较高拟合度(R2=0.92)。以上研究表明通过对特征性标记物评价BBB模型体内外的相关性有利于准确、快速地筛察各药物跨BBB的通透性。

3.3 其他方法 近年来同位素标记法也应用于药物BBB通透性的评价。如给药后跟踪脑部14C、3H标记物发射的β射线和125I标记物γ射线,无须组织匀浆后繁琐的药物提取操作就能开展药动学研究,且检测灵敏性高、特异性强。姜国华等［32］为了解钙调神经磷酸酶B亚基(CNB)的BBB通透性,采用Iodogen法进行125I标记,标记率高达85%,产物125I-CNB放化纯度为95.7%。小鼠静脉注射125I-CNB结果显示完整的CNB分子未能穿透BBB,而其降解肽段却能透过BBB进入脑组织。

此外,也有通过一定精确度的数学模型及计算机辅助设计来评价药物穿透BBB的研究报道［33-36］。随着生物信息技术发展,直接在体内成像的纳米材料也是一个令人激动的领域［37］,提供实时跟踪这些内在和外源性生物标记的纳米载体,利用正电子发射断层扫描(PET),单光子发射计算机断层显像(SPECT),磁共振成像(MRI),以及各种基于光学对比度的成像方法,如生物发光成像,荧光分子断层和光声断层成像(FMT),可以实现定量监测结构、功能和CNS疾病的分子通路。高分辨率的实时性能范式转移可视化成像平台的构建必将给评价指标提供最直接有效的证明。

4 结语与展望

BBB是保护CNS的天然屏障,可防止病原体及神经毒性物质影响大脑功能,同时也是CNS疾病中重要的病理损伤所在,在维持脑内环境稳态方面有重要作用。目前通过多种分离培养方法,从许多物种中进行内皮细胞的培养,甚至开展多重细胞立体培养,而动物的脑容量、脑组织分布、血液流速、微血管弹性及张力等因素都与人体有差异,导致数据相关性评价存在一定缺陷。然而,当前许多药物的CNS转运均采用正常的组织或动物作为BBB模型进行评价,忽视了CNS病理损伤状态时BBB通透性的变化,得出偏颇性结论。但在筛选CNS药物研发［38］、探究病原体感染机制［39,40］和干细胞个体化治疗［41］等应用中,构建高性价的体外BBB模型仍是不可或缺的研究工具。据报道［42］,以人干细胞培养的3D模型分化出的内皮细胞、紧密连接及外排转运蛋白的结构形态和功能表达是目前最契合人体解剖生理的模型。虽然体外细胞模型的建立途径有多种,但二元共培养模型在体内外相关性上优于单一模型,三元模型在多细胞的协同促进下整体又优于二元模型。不过每种模型都有其自身缺点和优势,需要研究者选择更符合自己研究目的、药性及可行条件的模型,并建立更为合理严谨的评价方法。

现已表明在不破坏BBB生理结构的情况下,通过结构修饰、制剂改造及联合用药等途径可不同程度改善药物BBB通透性［43］。如脂质体、纳米粒等新型递药系统能够靶向穿透BBB直达中枢神经病灶［44,45］,被视为治疗CNS疾病领域的战略方向。另一方面,中医学认为脑为奇恒之府、元神之官,所谓《灵枢·邪气脏腑病形》载：“十二经脉之三百六十五络,其血气皆上于面而走空窍”,《灵枢·海论》载:“人始生,先成精,精成而脑髓生”,而传统中药的多靶点、多途径的特点使其在脑系疾病的治疗中具有独特优势。如薄荷、冰片、麝香、川芎、石菖蒲等芳香类中药具有“醒脑开窍,引药上行”的功效,研究表明它们能不同程度上提高BBB的通透性［46-50］,其作用可能与中药有效成分能促进穿透BBB或改善BBB的超微结构和功能蛋白表达有关［51］。若利用纳米技术通过包封中药有效成分或在其转运蛋白表面靶向修饰制成中药纳米制剂,促进药物透过BBB,以此提高脑内药物浓度蓄积,发挥中药减毒增效的效果［52,53］,无疑将为开发CNS疾病药物创造巨大潜力。本课题组目前已初步开展相关中药与新剂型有机结合在治疗脑卒中方面的研究。虽然制备工艺、药效等方面处于探索阶段,但随着对BBB的生理机制以及CNS病理认识的深入,并借助生物信息技术的高新发展,建立更为科学理想的BBB模型与评价体系,必定能推动新型中药纳米脑靶向制剂的突破。