混合核苷片在急性胰腺炎大鼠细胞免疫调节中的作用研究

章诺贝 沈浩 刘惠芳

感染性胰腺坏死是脓毒症(acute pancreatitis,AP)晚期的严重问题,并导致AP高死亡率。虽然感染在AP中起主导作用,但AP大鼠死亡的直接原因不是感染本身,而是免疫系统的抑制和全身炎症反应［1,2］。大鼠AgBⅠ(抗原特异性T细胞激活的先决条件)和CD4+/CD8+比值是AP大鼠细胞免疫的重要指标。新近研究表明,在AP 中发现 AgBⅠ显著减少［3］。同时,外周血单核细胞的T细胞失衡可降低大鼠AP的组织学评分和存活率［4］。AP中的免疫抑制和由细胞凋亡引起的外周淋巴细胞减少与随后感染并发症的发展有关［5］。因此需要寻找一种新的方法增强AP的免疫反应和调节炎症反应。本研究选择48只AP 大鼠,旨在评估早期使用混合核苷片对AP免疫调节的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物模型与给药

1.1.1 动物 成年雄性SPF Sprague-Dawley 大鼠(体重200～250 g)来自南昌大学动物实验中心。所有大鼠都饲养在动物护理设施中,光/暗周期为12 h,并以标准商业饮食和随意饮水喂养。实验程序经南昌大学第二附属医院伦理委员会批准,并按照1983年赫尔辛基宣言的原则进行。

1.1.2 鼠AP模型建立 实验前大鼠禁食12 h,但可以自由饮水。所有大鼠均在密闭室中以4% 异氟醚(雅培实验室,上海,中国)2 L/min 氧气进行麻醉诱导,并在 2% 异氟醚 2 L/min 氧气中维持手术麻醉。AP 大鼠模型是通过将 1 ml/kg 体重的5%牛磺胆酸钠(STC)溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)标准化逆行输注到胆胰管中引起的。将生理盐水 (20 ml/kg) 注射到背部皮下以补偿手术后的体液流失。

1.1.3 给药 混合核苷片组给予混合核苷片,20 mg/片,3片/次,3次/d,研磨成粉后配蒸馏水10 ml后喂服,共14 d。在整个治疗过程中,对照组使用相同质量的淀粉配相同体积的蒸馏水喂服,共14 d。喂服。

1.2 检测与监测 大鼠检测从AP模型建立当天开始,并在给药后第15天再次开始。在实验设计中,大鼠在喂服药物后进行了为期30 d的监测或直至死亡(以先发生者为准)。在整个喂药过程和30 d时间内,记录感染率,包括脓毒症、腹腔内脓肿；记录死亡率。

1.3 细胞免疫测定 在AP模型建立当天和混合核苷片口服后第15、30天采集血样后进行分析。使用异硫氰酸荧光素标记的抗CD14(MultiSciences Biotech Co,上海)和藻红蛋白标记的抗AgBⅠ(MultiSciences Biotech Co,上海),通过流式细胞术(Becton Dickinson,Heidelberg,德国)测定单核细胞上AgBⅠ的表达。CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+也通过流式细胞术测量。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用单变量方差检验；计数资料以率(%)表示,采用Fisher 精确概率法检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组不同时间点细胞免疫指标比较 组内比较：对照组大鼠第0、15、30天CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、AgBⅠ组内比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。混合核苷片组大鼠第15、30天CD3+、CD4+、CD8+、AgBⅠ均高于本组第0天,差异均具有统计学意义(P＜0.05)；混合核苷片组大鼠第15、30天CD4+/CD8+有所增加,但组内不同时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05)。组间比较：第0天,两组大鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、AgBⅠ组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。第15、30天,混合核苷片组大鼠CD3+、CD4+、CD8+、AgBⅠ均高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；两组大鼠CD4+/CD8+比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 两组不同时间点细胞免疫指标比较()

表1 两组不同时间点细胞免疫指标比较()

注：与对照组比较,aP＜0.05；与本组第0天比较,bP＜0.05

2.2 两组感染及死亡情况比较 第15天,混合核苷片组脓毒症、腹腔内脓肿发生率分别为8.33%、4.17%,均低于对照组的50.00%、66.67%,差异具有统计学意义(P＜0.05)；第30天,混合核苷片组脓毒症、腹腔内脓肿发生率分别为4.17%、4.17%,均低于对照组的83.33%、83.33%,差异具有统计学意义(P＜0.05)。混合核苷片组死亡率为8.33%,低于对照组的70.83%,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 两组感染和死亡情况比较［只(%)］

3 讨论

混合核苷片可增强机体机能,使细胞顺利的进行代谢。然而,混合核苷片对AP免疫功能、感染并发症和大鼠预后的影响尚不清楚。本研究表明,混合核苷片可改善AgBⅠ的表达,并降低 AP 大鼠的感染率。

在最近的研究中,AP 中的单核细胞 AgBⅠ 表达和 CD4+/CD8+被视为 AP 大鼠急性期免疫反应指标,单核细胞 AgBⅠ表达在病程初期时减弱,并与免疫功能受损AP 大鼠的病情严重程度有关［6］。本研究中,AP中AgBⅠ表达在AP模型建立时明显较低,表明大鼠在疾病早期处于以循环淋巴细胞功能下降为特征的免疫抑制状态。免疫抑制发生在AP早期阶段,例如AgBⅠ的抑制,可能与AP 期间的感染并发症密切相关。研究报道,在AP 时,免疫抑制在早期即发生,在出现器官功能障碍的大鼠中,AgBⅠ阳性单核细胞的比例在发病初期较低,或在监测期间迅速下降［7］。有学者指出,单核细胞 AgBⅠ表达可预测AP大鼠早期发生的器官功能障碍风险,且AP大鼠的免疫抑制出现的早且发展迅速［8］。

本研究中,第14天,混合核苷片组AgBⅠ表达提高表明免疫抑制在炎症损伤缓解后解除。然而,对照组中AgBⅠ表达在第30天无明显变化,表明AP在30 d内免疫抑制持续存在。认为这一结果与过度炎症反应和随后的高感染率有关,在一定程度上导致免疫抑制和炎症反应失衡。与对照组相比,混合核苷片组第15、30天AgBⅠ表达显著增加,差异具有统计学意义(P＜0.05)。混合核苷片提高了AP 大鼠的CD4+/CD8+,组内不同时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05)。这表明混合核苷片可能保留炎症反应并避免抗炎阶段免疫功能的大量丧失。混合核苷片为合成人体核酸和多种辅酶的前体物质之一,是细胞活动的重要物质,参与体内核酸代谢、能量代谢和核蛋白的合成,可调整机体的免疫能力,具有修复受损细胞、增强淋巴细胞免疫功能的作用。

本研究于30 d观察期内检测了AP大鼠的免疫功能,以更好地了解混合核苷片是否可以改善免疫功能。将AgBⅠ表达与感染并发症进行对比分析,以更好地了解AP大鼠免疫抑制与临床结果之间的时间关系。

值得注意的是,混合核苷片组AgBⅠ水平在第15天有较大提升,与对照组相比保持较高水平,并伴随着第30天感染率下降。研究指出,单核细胞群中低AgBⅠ表达细胞的百分占比是脓毒症发展的可靠预测指标［9,10］。本研究发现,与对照组相比,接受混合核苷片治疗的大鼠第30天感染率显著下降。

综上所述,混合核苷片可以增强免疫反应,提高感染防御能力,降低AP大鼠的感染率和死亡率。