舒洛地特对膜性肾病大鼠肾组织中podocin、nephrin表达的影响

吝娜 曹磊 王保兴

膜性肾病(MN)是成人肾病综合征的常见病因,约占我国原发性肾病综合征的20%[1]，其病理基础主要为肾小球足细胞损伤[2]。MN发病率估计每年约为12/1 000 000[3],且有1/3患者进展为终末期肾病[4],给家庭和社会带来沉重的负担。MN患者处于高凝状态[5]。舒洛地特是一种葡萄糖胺聚糖[6]，为肝素类物质,早期主要作为抗血栓药物应用于临床。曾有报道称舒洛地特可辅助治疗MN，但具体机制不明[7]。本研究应用舒洛地特干预MN大鼠，观察MN大鼠肾小球podocin、nephrin的表达变化，从而探讨舒洛地特治疗MN的干预靶点。

材料与方法

1.材料：实验动物及药物：清洁级健康雄性SD大鼠40只，体质量160±20 g，由河北医科大学实验动物中心提供。舒洛地特胶囊(意大利阿尔法韦氏曼制药公司)。试剂：牛血清白蛋白(C-BSA第V组分，北京索莱宝科技有限公司)；无水乙二胺(EDA)、碳化二亚胺(EDC，上海阿拉丁试剂有限公司)；弗式不完全佐剂(美国sigma公司)；兔两步法免疫组化试剂盒、二胺基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥公司)；兔抗大鼠nephrin多克隆抗体(美国bioworld生物科技有限公司)；兔抗大鼠podocin多克隆抗体(武汉博士德生物公司)。仪器：透析袋(北京索莱宝科技有限公司)；真空冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司LGJ-10)；蛋白尿(24 h)分光光度计(gohnson-gohnson巴西强生公司)；脱水机、包埋机(德国LEICA TP 1020)；石蜡切片机(德国LEICA RM 2255)；烤片机(上海智城分析仪器制造有限公司)；切片漂烘温控仪(安徽电子科学研究所)；恒温水浴箱(北京西城区医疗机械厂)；低温冰箱(青岛海尔集团有限公司)；超低温冰箱(日本SANYO公司)；病理图像分析仪(麦克奥迪图像分析系统)；Olympus BX51光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；H-7500透射电镜(日本日立公司)。

2.方法

(1)模型制备及给药方式：将40只清洁级雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、低剂量舒洛地特组(C组)、高剂量舒洛地特组(D组)，每组各10只。参照改良Border法[8]制成阳离子化C-BSA。将制备好的C-BSA分装密封保存于-80 ℃冰箱内，注射前用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成溶液。取C-BSA 1 mg溶于0.5 mlPBS中，与等量不完全弗式佐剂充分混合乳化，除A组 外，其他3组大鼠均于双前肢腋下及腹股沟做多点皮下注射进行预免疫。预免疫1周后，开始正式免疫，取C-BSA 2.5 mg，溶于1 ml PBS中，B组、C组、D组大鼠均隔日尾静脉注射，连续4周。A组大鼠隔日尾静脉注射等体积的生理盐水。MN模型制备成功的标准为大量蛋白尿，肾小球基底膜增厚，上皮下电子致密物沉积，足细胞足突融合。造模成功后，C组和D组每只大鼠分别按照舒洛地特10 mg/kg、20 mg/kg剂量溶于生理盐水配成溶液灌胃，A、B组于C、D组正式免疫结束后同一天起，每日每只大鼠给予相同剂量生理盐水灌胃，4组灌胃均连续4周。实验期间动物自由进食、饮水，给予普通鼠饲料(河北医科大学实验动物中心提供)喂养，室温23 ℃左右，相对湿度40%～50%。最终B组大鼠死亡3只，剩余7只；余各组大鼠均为10只。

(2)24 h尿蛋白定量检测：各组大鼠分别于造模前、后及药物干预4周后应用代谢笼收集24 h尿液并记录尿量，用干化学法检测24小时尿蛋白定量。

(3)光镜、电镜检查:应用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，随后立即开腹解剖出双肾，去掉包膜，取肾上极皮质的肾组织在光镜和电镜下观察。光镜：肾组织固定于10%中性福尔马林固定液中(固定液与组织块体积比>20∶1)，乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)、过碘酸雪夫染色(PAS)、Masson 染色后在光镜下观察。电镜：肾组织固定于4%戊二醛中，用1%锇酸磷酸钠缓冲液固定，丙酮梯度脱水，常规包埋、聚合、切片，采用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，应用投射电镜观察肾小球基底膜、足突等的变化情况，并照相记录。

(4)免疫组化检测大鼠肾组织podocin、nephrin表达:肾组织固定、脱水、包埋切片、DAB显色，每张切片在肾皮质范围内随机选取10个肾小球(×400)，计算单位面积阳性染色区域平均积分光密度(IOD)，对各组均值比较，以图像半定量分析对肾小球足细胞podocin、nephrin的阳性面积与着色强度进行综合评价。

结 果

1.4组大鼠24 h尿蛋白定量比较：造模结束后检测造模大鼠尿蛋白，显示大量蛋白尿；随机抽取2只大鼠进行肾组织光镜、电镜检查，观察到肾小球基底膜增厚，上皮下电子致密物沉积，足细胞足突融合，证实MN造模成功。造模后，与A组比较，B、C、D组大鼠24 h尿蛋白定量均显著升高(P<0.05)。治疗后，C、D组大鼠24 h尿蛋白定量较同组造模后及B组同期均降低(P<0.05)；D组24 h尿蛋白定量较C组同期显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠24 h尿蛋白定量比较

2.4组大鼠肾组织病理形态学观察：光镜下，A组大鼠肾小球形态基本正常，毛细血管袢开放良好，无固有细胞增多，无基底膜增厚；B组大鼠肾小球固有细胞增多，基底膜明显增厚；C、D组大鼠肾小球固有细胞轻度增多，基底膜增厚较B组减轻。电镜下，A组大鼠足细胞结构清晰，足突排列整齐；B组大鼠肾小球基底膜弥漫增厚，上皮下电子致密物沉积，足细胞足突广泛融合或消失；C组大鼠肾小球基底膜不规则增厚，上皮下电子致密物沉积，足突部分融合；D组大鼠基底膜轻度增厚，上皮下少量电子致密物沉积，足突部分融合。见图1(图1A～P)。

3.4组大鼠肾组织中podocin、nephrin IOD比较：从免疫组化染色中可观察到podocin、nephrin两种蛋白表达于肾小球上皮下。与A组比较，B、C、D组大鼠podocin、nephrin IOD均降低；与B组比较，C、D组大鼠podocin、nephrin IOD均升高；与C组比较，D组大鼠podocin、nephrin IOD明显升高(P<0.05)。见表2、图1(1Q～X)。

图1 4组大鼠肾脏组织病理染色及免疫组化结果(A、E、I、M、Q、U：A组；B、F、J、N、R、V：B组；C、G、K、O、S、W：C组；D、H、L、P、T、X：D组；A、B、C、D：HE染色，×200；E、F、G、H：Masson染色，×400；I、J、K、L：PAS染色，×400；N：电镜，×25 000；M、O、P：电镜，×20 000；Q、R、S、T：podocin免疫组化染色，×200；U、V、W、X：nephrin免疫组化染色，×200)

表2 4组大鼠肾组织中podocin、nephrin IOD比较

讨 论

MN临床上常表现为肾病综合征或无症状蛋白尿,部分患者有高血压、肾功能损害[9]。在形态学上，本病的特点是上皮下免疫复合物沉积，含有免疫球蛋白(Ig)G和补体，足细胞足突融合消失，肾小球基底膜(GBM)增厚[10-11]。其肾小球病变可分为4个阶段，第1阶段的特点是上皮下存在少量免疫复合物沉积，GBM光镜下观察可能出现正常或稍增厚；第2阶段可见“钉突”形成；第3阶段，免疫复合物嵌入 GBM；第4阶段，GBM不规则增厚，免疫复合物重吸收[12]。

MN是一种自身免疫性足细胞病[13]。虽然MN是免疫复合物介导的疾病,但其肾组织病变主要集中在肾小球脏层上皮细胞,即足细胞。足细胞在肾小球基底膜上的稳定附着和功能发挥依赖于一组足细胞相关蛋白维持，根据其在足细胞分布和功能不同,可将其分为裂孔膜蛋白、顶膜区蛋白、基底膜区蛋白和细胞骨架蛋白。 裂孔膜蛋白包括 nephrin、podocin、CD2AP 等[14],其中 nephrin 是裂孔膜的关键组成。nephrin 作为裂孔膜的关键组成，能通过介导上皮细胞与基质相互作用来影响 GBM 的通透性和基质的沉积，从而影响肾脏滤过膜结构与屏障功能的完整性[15]。有研究表明，nephrin mRNA和蛋白表达降低可导致裂孔隔膜功能受损,从而导致大量蛋白尿[16]。也有研究表明，nephrin基因敲除小鼠出生时即表现为大量的蛋白尿,出生后不久即死亡[17]。Podocin 编码基因 NPHS2 敲除小鼠出生前即表现为蛋白尿，出生后数天死亡，电镜可观察足突广泛融合，裂孔膜消失[18]。MN中可观察到podocin蛋白表达下调，足细胞损伤和nephrin、podocin蛋白在肾小球的表达下降与蛋白尿的发生及发展密切相关[19]。足细胞损伤程度越大，nephrin和podocin蛋白表达下调越多，足细胞之间裂孔膜的结构破坏越严重，导致蛋白尿产生。大鼠MN模型早期nephrin、podocin表达减少可能使足细胞裂孔膜结构的完整性受损，肾小球滤过屏障破坏，从而导致蛋白尿[20]。

本实验给予大鼠尾静脉注射C-BSA进行模型复制，造模完成后出现大量蛋白尿，肾小球固有细胞明显增多，基底膜增厚，上皮下大量电子致密物沉积，足细胞足突广泛融合或消失等MN特征。经舒洛地特干预后MN大鼠蛋白尿明显减少，可见舒洛地特可改善MN大鼠大量蛋白尿症状。本实验病理结果亦显示经舒洛地特治疗的各组大鼠肾小球固有细胞较少，毛细血管基底膜增厚较轻、免疫复合物沉积较少、足细胞损伤较轻，结果提示舒洛地特对MN大鼠肾小球的病理形态有改善作用。免疫组化结果表明，MN大鼠肾组织中nephrin和podocin蛋白表达量减少，表明在MN大鼠中足细胞有明显的损伤。经舒洛地特干预后大鼠肾组织nephrin和podocin蛋白表达有不同水平的上调，表明舒洛地特可改变MN大鼠足细胞骨架相关蛋白表达，进而改善足细胞结构损伤，且有剂量依赖性。

综上所述，舒洛地特对MN具有治疗作用，同时具有剂量依赖性，其可通过上调MN大鼠肾组织nephrin和podocin蛋白的表达水平，进而改善足细胞损伤、维持足细胞功能、减少蛋白尿。这可能是其治疗MN的作用机制之一。