诱变选育法夫酵母耐热突变株及基因组变异检测

梁紫涵， 刘诗文， 申镕宾， 刘冰南

(大连工业大学 生物学院，辽宁 大连 116034)

虾青素是天然的抗氧化剂和着色剂，主要存在于微生物、藻类和部分水生动物体内，具有提高机体免疫力，防治多种疾病的作用，在食品、医药和化妆品等领域有广泛的应用[1-2]。法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)是天然虾青素产生菌，其发酵过程不需要光照，培养基条件简单，培养周期短，能够在发酵罐中高密度培养，因此具有工业化生产虾青素的潜力[3-4]。Miao等[5]通过菌株诱变和基因工程改造，获得的法夫酵母工程菌株虾青素产量达到248.6 mg/g。最新研究表明，在10 m3的发酵罐中，经过培养基优化，虾青素产量达到360.3 μg/mL[6]。目前，虾青素产量已基本能够达到工业化需求，但发酵温度低仍是制约法夫酵母工业化生产虾青素的关键因素。通常野生型法夫酵母最适细胞生长和色素合成的温度为17～21 ℃，因此在大部分地区夏季生产成本增加[7]。微生物发酵生产中产生大量的发酵热，生长温度低意味着需要消耗更多的冷却水和能源来维持发酵温度，大规模生产中甚至需要投入制冷设备，大大增加了成本。因此，筛选出法夫酵母耐热菌株对降低虾青素生产成本至关重要。龚玉姣等[8]通过抗霉素A筛选，得到了能在28 ℃生长的法夫酵母突变株。黄晓燕[9]通过原生质体融合技术获得了能在30 ℃下生长的融合菌株，但虾青素产量降低。目前虽然获得了一些法夫酵母耐热菌株，但对法夫酵母的耐热机制还不清楚。本研究通过诱变获得法夫酵母耐热突变株，并对该突变株进行基因组重测序，分析其突变位点，为后续的法夫酵母耐热机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)CBS6038，购自韦斯特迪克真菌生物多样性研究所。法夫酵母YB25是法夫酵母CBS6938经亚硝基胍(NTG)诱变后，筛选得到的突变株。

1.1.2 培养基 土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养基，液体培养时不添加琼脂(PD)。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 酵母核酸纯化试剂盒(Takara),NTG，氯化钠，葡萄糖，柠檬酸。三元叠加振荡器(ZWYR-D2403，上海智城分析仪器制造有限公司)；高效液相色谱仪(E2695，Waters Corporation)；超微量紫外分光光度计(K5800，北京凯奥科技发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 挑取法夫酵母平板中的单菌落，接种于5 mL PD培养基中，20 ℃，180 r/min培养24 h。取500 μL菌液接种于50 mL PD培养基中，20 ℃，180 r/min培养12 h，菌液经5 000 r/min离心10 min后得到法夫酵母菌体,无菌生理盐水洗涤两次，10 mL柠檬酸缓冲溶液重悬，调整菌液菌数为107个/mL。

1.2.2 NTG诱变 选择不同终浓度的NTG处理法夫酵母细胞，终浓度分别为20、40、60 μg/mL。经生理盐水清洗后重悬，稀释菌液浓度至103个/mL，分别取100 μL菌液涂布于PDA平板，以未经NTG处理的法夫酵母细胞作为对照组，20 ℃培养5 d，计算致死率。取一定量的上述菌液于50 mL离心管中，加入NTG溶液，使菌液NTG终浓度为20 μg/mL，不断振荡10 min后，10 000 r/min离心4 min，弃上清。加入1 mL生理盐水重悬上述实验所得菌体，取100 μL涂布于PDA平板，倒置于25 ℃培养箱中培养，筛选出红色菌落。将已筛选出的红色菌落，接种于新鲜PD培养基中，25 ℃，180 r/min培养96 h，测定该诱变菌株虾青素含量。经过5次传代培养，测定该诱变菌株每一代菌体的虾青素合成量，以此鉴定该诱变菌株能否在25 ℃条件下稳定生长并生产虾青素。虾青素含量测定方法参考文献[10]。

1.2.3 诱变菌株法夫酵母YB25全基因组重测序 首先提取法夫酵母YB25基因组DNA(酵母核酸纯化试剂盒，Takara)，并用超微量紫外分光光度计检测DNA的浓度，然后将样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司建库测序。

1.2.4 数据分析 参考基因组选择法夫酵母基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/43947?genome_assembly_id=995437)，测序数据经过质控去除有接头、无法确定碱基含量超过10%以及低质量的数据后，使用BWA软件与参考基因组进行比对，获得单核苷酸多态性(SNP)、长度小于50 bp的小片段插入与缺失(InDel)、结构变异(SV)和拷贝数变异(CNV)等信息，具体分析软件和方法参考周梦琳等[11]的方法，简述如下。应用SAMTOOLS软件检测SNP和InDel；利用BreakDancer软件进行SV检测；通过CNVnator软件进行CNV检测。所有变异检测后，使用ANNOVAR进行变异注释。

2 结果与分析

2.1 诱变筛选耐热突变株

2.1.1 最适NTG诱变浓度 诱变过程中，需保持一定NTG浓度以达到需要的致死率和突变率。本研究发现，NTG终浓度在40 μg/mL和60 μg/mL时处理法夫酵母，致死率高达99.24%和99.87%，而NTG终浓度在20 μg/mL时，处理法夫酵母的致死率为80.7%。因此，选择20 μg/mL NTG作为诱变条件。

2.1.2 诱变菌株的筛选及遗传稳定性验证 经过大量诱变和筛选，获得一株能够在25 ℃条件下生长并合成虾青素的菌株(图1)。结果表明，经过五代培养，每一代诱变菌株合成虾青素的能力未发生变化。表明该诱变菌株在25 ℃培养条件下，能够稳定生长并合成虾青素，将该菌株命名为法夫酵母YB25。

图1 诱变菌株各代菌体虾青素含量Fig.1 Astaxanthin content in different generations of mutagenized strain

2.2 法夫酵母YB25发酵特性

如图2所示，菌株YB25在25 ℃条件下培养54 h时，OD600值达到41.76，然后菌体生长进入稳定期，直至培养到96 h，OD600值无显著性变化。

培养72 h时，菌株YB25虾青素产量达到182 μg/g细胞干重(DCW)，与野生型法夫酵母发酵84 h的虾青素产量相当(184 μg/g DCW)。培养120 h时，虾青素产量达到237.19 μg/g DCW，考虑到时间的延长将提高培养成本，所以培养截止至120 h。

与法夫酵母CBS6938 20 ℃培养相比，菌株YB25在发酵初期(0～24 h)生长较为缓慢，这是因为培养温度提高，菌体的生长需要一定的适应过程。菌株YB25在24～54 h发酵时间段，菌体生长进入对数期，生长速度快。生成相同含量的虾青素(184 μg/g DCW)，菌株YB25比野生型法夫酵母发酵所用时间缩短了12 h，表明菌株YB25与野生型法夫酵母相比减少了培养时间，从而降低了生产成本。培养到120 h，虾青素最大合成量提高了29%。

图2 菌株YB25发酵动力学曲线Fig.2 YB25 fermentation curve

2.3 法夫酵母YB25基因组重测序

2.3.1 数据质量控制 提取后的菌株YB25基因组DNA，经过浓度纯度检测，文库构建，上机进行Illumina HiSeq测序，在数据比对之前过滤筛选了原始数据，控制数据的质量(表1)。如表1所示，经过去除接头和低质量数据等，最终得到的clean reads占总数据的99.31%。进行数据质量控制之后，可以保证后续与法夫酵母基因组进行比对的数据质量更高，从而保证后续比对分析结果的准确性。

表1 原始数据过滤结果

2.3.2 SNP检测 通过与法夫酵母野生菌株基因组的比对发现，菌株YB25发生碱基转换435个，碱基颠换191个，杂合率为0.030‰，SNP位点总数为626个，49个变异位于外显子区域，85个非同义突变。通过分析法夫酵母合成虾青素代谢通路上关键基因的碱基突变情况，发现在虾青素合成酶基因crtS上一个G转换为A，该碱基突变导致菌株YB25虾青素合成酶上第401位氨基酸由天冬氨酸变成天冬酰胺，推测这一变化可能是诱变菌株能够高产虾青素的原因。另外，乙酰辅酶A羧化酶基因1 393位的A突变为C，使得乙酰辅酶A羧化酶第465位蛋氨酸突变为亮氨酸。Δ9脂肪酸去饱和酶基因中第38位的T突变为C，使Δ9脂肪酸去饱和酶第13位异亮氨酸突变为苏氨酸；第199位A突变为G，使第67位赖氨酸突变为谷氨酸；第295位T突变为C，使第99位丝氨酸突变脯氨酸。

2.3.3 InDel检测 通过与法夫酵母野生菌株基因组的比对，利用软件对所得结果进行分析，菌株YB25中发生小片段的插入和缺失序列共184个，InDel杂合率为0.009‰。有7个变异位于外显子，其中有2个片段的缺失导致该基因阅读框改变，有4个片段缺失和1个片段插入导致所编码氨基酸的缺失或插入，但是并未改变基因阅读框。这些变异中，二酰甘油酰基转移酶基因的1 127～1 135发生非移码缺失，使二酰甘油酰基转移酶第376～379位氨基酸缺失。

2.3.4 SV检测 通过与法夫酵母野生型菌株基因组的比对，利用软件对所得结果进行分析。菌株YB25中发生大片段的插入、缺失、倒置、易位等现象共703个，其中60个变异位于外显子区域，36个变异位于内含子区域，8个变异位于基因间区。结构变异对法夫酵母基因组产生较大影响，特别是变异位于编码区时，会导致蛋白质序列和结构的改变，从而影响该蛋白质的功能。但SV也可能是基因多样性的来源，从而赋予生物新的功能。

2.3.5 CNV检测 通过与法夫酵母野生型菌株基因组的比对，利用软件对所得结果进行分析。菌株YB25中发生基因组片段拷贝数增加或减少的现象共293个，其中78个变异位于外显子区域，28个变异位于内含子区域，58个变异位于基因间区。拷贝数增加40个，减少253个。

2.3.6 基因组结构变异可视化 为了形象化展示法夫酵母YB25基因组中的结构变异，绘制了Circos 分布图(图3)。由于基因组数据庞大且复杂，通过可视化，可以直观地展示法夫酵母YB25基因组上的SNP、InDel、SV和CNV等结构变异，更好地进行差异比较。

图3 法夫酵母YB25基因组结构变异分布Fig.3 Distribution of genome structure variation由外到内依次为染色体、SNP、InDel、CNV 增加、CNV 减少、SV插入、SV缺失、SV 倒位、SV染色体内部重排、SV 染色体间重排From the outside to the inside in order: chromosome, SNP, InDel, the increase of CNV, the decrease of CNV, SV insertion, SV deletion, SV inversion, chromosome internal rearrangement, chromosome rearrangement

3 讨 论

NTG是重要的化学诱变剂，具有诱变效率高等特点，其诱变机理清楚，已经广泛应用于微生物遗传育种等技术中[12]。NTG剂量会导致致死率和突变效率的差异，有研究表明致死率达到80%左右时，菌株诱变效果较好[13]。本研究通过NTG诱变筛选，获得了能在25 ℃发酵生产虾青素的法夫酵母突变株YB25，其虾青素产量比野生型菌株提高29%。其他一些研究也获得了耐热菌株，一般能在25 ℃下生长并合成虾青素，例如，通过细胞融合，获得最适生长温度为25 ℃并合成虾青素的融合菌，但其虾青素产量与法夫酵母亲株NT221比较下降了64.4%[14]。Miao等[15]使用60Co与NTG配合诱变，获得25 ℃生长并高产虾青素的法夫酵母菌株。本研究获得的法夫酵母YB25可以作为后续代谢工程改造的底盘细胞，为实现虾青素的高产提供参考。

为了解法夫酵母YB25在基因组水平上产生了哪些变异，本研究通过基因组重测序，获得了突变菌株法夫酵母YB25的遗传图谱和基因组结构变异结果。基因组重测序技术能够为遗传性状的进化机制提供重要的数据支持[16]。SNP、InDel、SV和CNV等变异使菌株YB25的基因组与野生型菌株相比发生了显著变化。在众多的结构变异中发现，多个与脂代谢相关基因发生突变，包括乙酰辅酶A羧化酶基因、Δ9脂肪酸去饱和酶基因和二酰甘油酰基转移酶基因。有研究表明，脂肪酸的饱和程度会影响菌株的热稳定性，不饱和/饱和脂肪酸比率对菌株长期的热耐受性是至关重要的[17]。通过对酿酒酵母中4 792个基因进行耐热基因高通量筛选发现，只有乙酰辅酶A羧化酶基因缺失对酵母的耐热性有中度影响[18]。由此推测法夫酵母的耐热性可能与脂代谢相关。另外，虾青素合成酶基因的突变可能与法夫酵母YB25的虾青素产量提高有关，该酶催化β胡萝卜素合成虾青素，其过表达有利于虾青素的生产。