红平菇锌多糖咀嚼片制备工艺及其体外抗氧化活性研究

张梦宇， 侯敏婕， 时焕军， 贾 乐， 张建军

(山东农业大学 生命科学学院，山东 泰安 271018)

红平菇(Pleurotusdjamor)，又名粉褶侧耳，是近年来我国食用菌种植行业的热门菌种，具有很高的营养价值。与普通平菇(糙皮侧耳，Pleurotusostreatus)相比，水分与脂肪含量较低，碳水化合物、纤维素和矿物质较高[1-3]。多糖作为食用菌中重要的活性成分，具有抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、提高免疫力[6]、抑菌[7]等多种生物活性，且被证实无毒无害，其研究已成为生物医药领域研究的热点[8]。抗氧化活性物质能够有效地减弱人体内多余自由基带来的损伤，在预防心脑血管疾病、肝病、炎症等方面具有重要意义。锌是人体必需的微量元素之一，参与体内酶类、核酸、蛋白质、激素等代谢过程，具有促进皮肤、骨骼、性腺等器官的发育、维持神经活动兴奋性、协同胰岛素增强机体组织吸收葡萄糖改善糖尿病症状等多种功能[9-10]。人体中锌的每日需求量约22 mg，我国饮食习惯中，锌不能得到充分的补充，儿童缺锌率比较高。现市面上的补锌产品多为无机锌盐，如果剂量控制不当不仅无法补充锌元素还有可能对机体产生毒副作用，因此开发更为安全有效的锌补充剂是目前研究的热点[11]。通过食用菌富集作用，无机锌与多糖结合成为有机锌多糖，降低了无机锌的毒性，更有助于人体的吸收，并且稳定性较好，更容易贮存、运输，避免营养成分的损失[12]。现已有多种关于食用菌锌多糖的研究[13-16]，但未见红平菇和其开发应用的报道。目前红平菇多以鲜食为主，保鲜期和货架期均较短，制约着红平菇产业的发展，而将红平菇开发成为功能性食品的研究相对较少[17-18]。咀嚼片是一种经过口腔咀嚼融化后直接吞服的片剂类型，与其他片剂相比，咀嚼片具有携带、保存、食用、运输方便等优点，且可以根据消费者的喜好设计出不同形状与大小[19]。所以开发一种以红平菇锌多糖为原材料的健康食品具有较大的市场和发展前景。本研究主要采用液体发酵培养富锌菌丝体，以多糖得率为指标优化红平菇锌多糖的提取工艺，再进一步试验得出红平菇锌多糖咀嚼片的最佳配比工艺，并检验咀嚼片成品的抗氧化活性，旨在为产品的功能营养提供一定的科学依据，为未来红平菇锌多糖功能性食品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 红平菇菌种(Pleurotusdjamor)为山东农业大学食药用真菌实验室保存。

1.1.2 培养基 ①固体培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1，水1 L，pH自然;②液体发酵培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20， KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1，水1 L，pH自然。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(纯度>97%)为分析纯级，木糖醇、柠檬酸、甘露醇、硬脂酸镁、乙酸锌为食品级，均为市售国产。粉碎机(XC-750,浙江永康石柱铂欧五金厂);恒温水浴锅(DK-S24,上海精宏实验设备有限公司);台式离心机(TDL-5-A,上海安亭科学仪器厂);单冲压片机(THDP-6,上海天阖机械)，紫外可见分光光度计(UV-2100,龙尼柯(上海)仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Zn2+对红平菇菌丝体生长的影响 参考实验室前期试验发现,培养基中添加乙酸锌，经过发酵后可以得到富锌多糖[20]。以乙酸锌作为锌源配置不同梯度Zn2+浓度的液体培养基，浓度设定为0、10、30、50、70、90 mg/L，每个浓度3组重复。在长满红平菇菌丝体的平皿培养基上取一块约1 cm2的菌种块接入盛有200 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，25 ℃静置24 h后，130 r/min振荡培养7 d。离心，将菌丝体60 ℃烘干至恒重，测定菌丝体生物量(g)。

1.2.2 红平菇菌丝体富锌培养 将菌种按照斜面培养基→固体平皿培养→接种瓶液体培养的顺序活化后，将置于接种瓶的菌种接入装有70 L含锌液体培养基的控温发酵罐中26 ℃通气培养10 d左右[21]。

1.2.3 红平菇锌多糖提取优化 ①Plackett-Burman(PB)试验：采取9因素3水平设计试验，根据设定的条件分组提取多糖，试验因素水平设计及编码见表1。②响应面试验：根据PB试验的结果，选出3个对红平菇锌多糖得率影响最为显著的因素(加水倍数、提取时间和醇沉时间)，进行下一步试验。设计试验方案见表2。

表1 PB试验因素和水平表Table 1 PB test factors and level table

表2 响应面试验因素水平及编码Table 2 Response Surface Methodology test factor levels and codes

1.2.4 红平菇锌多糖得率测定 采用苯酚-硫酸法[22]对多糖含量进行测定。以葡萄糖浓度为横坐标，OD490为纵坐标，制作葡糖糖标准曲线(y=0.017 9x-0.037 6)。利用待测溶液在490 nm下的吸光度与葡萄糖标准曲线对比换算得出多糖浓度。

1.2.5 红平菇锌多糖咀嚼片配方优化 ①单因素试验：以感官评分作为考察标准，利用单因素试验分别考察红平菇锌多糖添加量(5%、15%、25%、35%、45%，占颗粒重的百分数，下同)，木糖醇添加量(5%、15%、25%、35%、45%)，柠檬酸添加量(0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%)，硬脂酸镁添加量(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)4个因素对感官评分的影响。试验采用粉末直接压片法制备咀嚼片，并对其进行评分。评分标准详见表3[23]。②正交试验：在单因素试验感官评分得到的结果基础上，以红平菇锌多糖(A)、木糖醇(B)、柠檬酸(C)和硬脂酸镁(D)4个因素作为指标进行正交试验，其正交试验水平如表4所示。以表3感官评价为标准打分，得到最佳工艺配比。

表3 咀嚼片的评分标准Table 3 Scoring criteria for compressed films

表4 红平菇锌多糖咀嚼片辅料配比优化正交试验因素水平Table 4 Orthogonal test ofP.djamorzinc polysaccharide chewable tablets

1.2.7 数据统计处理 试验数据采用Design-Expert和SPSS软件进行统计分析，采用Origin 2021作图。

2 结果与分析

2.1 菌丝体生物量富锌培养

以生物量作为指标观察Zn2+含量对红平菇菌丝体生长的影响，结果见图1。经过一段时间的培养后，随着乙酸锌添加量的增加，菌丝体的生物量逐步增加，当浓度大于50 mg/L时，菌丝体生物量明显降低，表明过高浓度乙酸锌的加入开始抑制菌丝体的生长，因此选择在培养基中添加50 mg/L乙酸锌进行后续培养。

图1 不同Zn(CH3COO)2浓度下菌丝体生物量Fig.1 Mycelial biomass under different Zn(CH3COO)2concentrations

2.2 红平菇锌多糖提取优化

2.2.1 PB试验 PB试验结果见表5。PB试验设计中选择9因素3水平作为考察对象，共设计17组，最后5组作为试验中心点，用来误差评估。方差分析结果见表6。方差分析结果显示此模型显著，回归性较好。通过对P值的分析，影响红平菇锌多糖提取量的因素显著性为提取时间>醇沉时间>加水倍数>pH>提取次数>提取温度>乙醇浓度>乙醇倍数>醇沉温度。因此选取其中最显著的3个因素进行下一步的响应面分析试验。

表5 PB试验结果Table 5 PB test results

表6 PB试验的方差分析Table 6 Analysis of variance of PB test

表7 响应面试验结果Table 7 Response surface methodology experimental results

表8 响应面试验的方差分析Table 8 Analysis of variance of response surface methodology test

图2 3种因素两两相互作用对锌多糖得率(R1)影响的响应面图和等高线图Fig.2 Response surface plot and contour plot of the effect of three factors on the yield of zinc polysaccharide(R1)加水倍数与醇沉时间、加水倍数与提取时间、醇沉时间与提取时间的响应面图(A、B、C)与等高线图(D、E、F)Response surface plots (A, B, C) and contour plots (D, E, F) of water addition versus alcohol settling time, water addition versus extraction time, and alcohol settling time versus extraction time

2.3 红平菇锌多糖咀嚼片制备工艺

2.3.1 单因素试验图 由图3A看出，在其他辅料比例固定的情况下，当红平菇锌多糖的添加量占比25%时，感官评分最高，添加量继续增加评分则发生下滑，原因可能是红平菇特有气味过重导致，所以对红平菇锌多糖占比15%、25%、35%三个效果较好的水平进一步考察。由图3B可以看出，当木糖醇添加量在25%时所得到的感官评分达到最高，其他比例评分较低的原因可能是甜度不适和口感较差。由图3C看出，当柠檬酸的添加量在0.5%、1.5%、2.5%三水平时所得到的感官评分较高，浓度大于2.5%后评分发生下降，可能是由于柠檬酸含量的增加导致咀嚼片变酸，口味变差。在硬脂酸镁添加量的单因素试验结果可以看出，添加量为0.8%时感官评分达到最高，作为润滑剂，其他比例评分较低的原因应为咀嚼片质地与外观不佳，所以后续试验选择0.6%、0.8%、1.0%进行考察。

图3 咀嚼片单因素试验结果Fig.3 Chewable tablet single factor test resultsA:红平菇锌多糖添加量；B:木糖醇添加量；C:柠檬酸添加量；D:硬脂酸镁添加量A: P. djamor zinc polysaccharide addition; B:Xylitol addition； C:Citric acid addition； D:Magnesium stearate addition

2.3.2 正交试验 通过单因素试验得到红平菇锌多糖、木糖醇、柠檬酸和硬脂酸镁的大致添加范围，对4个因素进行L9(34)的正交试验，试验结果见表9。从表9结果可以看出4种原料添加量对红平菇锌多糖咀嚼片影响的大小排序为木糖醇>硬脂酸镁>锌多糖>柠檬酸。由K值可以得出，试验最优组合为A2B2C3D3，所以红平菇锌多糖咀嚼片最佳工艺配比为红平菇锌多糖25.0%、木糖醇25.0%、柠檬酸1.5%、硬脂酸镁1.0%。对最佳工艺配比制作的红平菇锌多糖咀嚼片进行感官评分检测，最佳评分为(39.7±2.1)分。

表9 红平菇锌多糖咀嚼片辅料配比正交试验结果Table 9 Orthogonal test results of adjuvant ratio of zinc polysaccharide chewable tablets

总体来看，红平菇锌多糖经过挤压成为咀嚼片后抗氧化能力并没有减弱，反而和辅料一起表现出了更为优秀的效果，同时富锌培养所得的锌多糖与咀嚼片的抗氧化活性优于未经富锌的多糖与咀嚼片，表明锌可能具有增强抗氧化活性的能力。

2.4 红平菇锌多糖咀嚼片体外抗氧化能力

由图4A中可以看出，红平菇锌多糖咀嚼片对于羟基自由基具有良好的清除作用，且呈现剂量相关性，当浓度为1 mg/mL时，红平菇锌多糖咀嚼片和红平菇锌多糖的清除率分别达到(39.1±1.07)%、(54.8±1.57)%，红平菇多糖与咀嚼片较弱于富锌后的效果。图4B展示了红平菇锌多糖咀嚼片优秀的超氧阴离子清除能力，当浓度为1 mg/mL时，清除率达到(22.6±1.69)%，同浓度下的红平菇多糖咀嚼片达到(19.31±0.79)%，红平菇锌多糖咀嚼片的效果更优。图4C中则可以看出对于DPPH自由基，红平菇多糖、锌多糖和制备的咀嚼片均表现出一定的清除能力，当浓度增加时，清除率也随之增加，当浓度为1 mg/mL时，清除率依次分别为(21.8±1.89)%、(19.8±1.06)%、(35.2±1.63)%和(32.0±1.84)%。

图4 红平菇锌多糖咀嚼片体外抗氧化能力Fig.4 Antioxidant ability ofP.djamorzinc polysaccharide chewable tabletsinvitroA：羟基自由基清除率;B：超氧阴离子清除率;C：DPPH清除率A: Hydroxyl radical scavenging rate; B: Superoxide anion scavenging rate; C: DPPH scavenging rate

3 讨 论

为提高锌多糖的提取效率，本研究对红平菇富锌菌丝体多糖的提取条件进行了优化，结果显示，以乙酸锌作为外加锌源时，50 mg/L浓度时菌丝体生长最快，郑岚[13]的研究发现锌添加量80 mg/L是光帽鳞伞菌丝体液体发酵效率最高的浓度;陈丽[14]得出硫酸锌添加量为0.4 g/L时，红汁乳菇菌丝体最大生物量达14.4 g/L，分析不同的原因主要是菌种间的差别，不同菌种对于锌的耐受程度不同。红平菇锌多糖的提取优化结果显示最佳条件为料液比1∶31、提取时间2.5 h、醇沉时间15 h，在该条件下，红平菇锌多糖最佳得率为(1.04±0.03)%。本研究对于红平菇锌多糖的提取方法只对水提醇沉法进行了探究，后续试验可在此基础上引入酸碱辅助或超声波辅助，对比效果找出更佳的提取方法。

有研究表明，咀嚼片产品表面积增大、溶出快，提高生物利用率，对于一些吞咽困难者、肠胃不好者、老人和儿童较为适用，一些长期服药产生的拒药心理的患者也容易接受[27]。由于咀嚼片是在口腔内嚼碎后服用，对口感要求较高，一般通过对辅料的选择改善产品口感。本研究以外观、口感、质地及风味的多指标评分法，对咀嚼片的辅料添加比例进行控制，通过正交试验确定红平菇锌多糖咀嚼片最佳配比为红平菇锌多糖25.0%、木糖醇25.0%、柠檬酸1.5%、硬脂酸镁1.0%、甘露醇47.5%。目前制片的方法有粉末直接压片法和制粒压片法[28]。本研究采取的粉末直接压片法是直接将原料粉末和辅料混合后进行压制，优点在于工艺简单、操作方便、节约耗能和保证产品的稳定性，目前此法也越来越受行业接受，逐渐取代制粒压片法[29]。

根据最佳配比制作的红平菇锌多糖咀嚼片表面光滑、口感细腻、酸甜可口，携带方便，具有小巧、方便的特点。研究表明，咀嚼片的抗氧化活性良好，对羟基自由基、超氧阴离子等均有较好的清除作用，与多糖对比发现经过处理制成咀嚼片后功效并未受损反而效果更佳，与王雪梅等[30]的结果类似，经过富锌处理的红平菇锌多糖和咀嚼片均表现出了更加优秀的效果，这与刘芳等[31]对金针菇锌多糖的研究结果一致。本研究在制备咀嚼片的过程中并未以改变红平菇特有风味采取更多尝试，后续研究可以根据消费市场需求选择添加更多种类矫味剂，尝试生产更多风味红平菇锌多糖咀嚼片。