微塑料附着微生物研究进展

董旭日， 朱礼鑫， 徐佳奕， 李道季

(华东师范大学 河口海岸学国家重点实验室，上海 200241)

20世纪以来，全球塑料产量数目持续高值，2019年已经达到3.68亿t[1],废物管理机制的不合理使得废塑料进入环境后，在物理、化学和生物等因素作用下逐渐分裂为小于5 mm的微塑料。微塑料在环境中广泛存在，陆地[2]、海洋[3]甚至极地地区[4]都有分布。细菌生物被膜 (Bacterial Biofilm) 是许多黏附在生物或非生物表面的细菌通过分泌蛋白质、脂质、胞外多糖等复合物, 形成包裹细菌的膜状物，它能使细菌更好地适应外界环境，从而有利于自身的生长繁殖[5]。附着于微塑料表面的细菌，可以形成生物被膜，而且其生物被膜中还可能含有降解塑料的细菌，进而导致“微塑料-细菌”颗粒密度、浮力和下沉速率的改变。此外，生物被膜的形成可能会影响微塑料的非生物降解过程。一方面，当生物被膜附着于微塑料表面时，较厚的被膜可使微塑料免受阳光中紫外线的照射；另一方面，附着微生物会导致微塑料在水体中的浮力变化，从而改变微塑料在水体中的分布，减少阳光直接照射引起的塑料降解。塑料进入海洋后，表面附着微生物形成“塑料圈”[6]。塑料在海洋环境中难以降解，疏水的表面能促进微生物的定殖和生物被膜形成，“塑料圈”可能是海洋中微生物新的栖息地。Zettler等[6]在北大西洋多个水域采集塑料，利用测序和扫描电子显微镜分析塑料表面附着微生物的群落特征，发现塑料表面是由自养生物、异养生物、捕食者和共生体形成的微生物群落。其研究还表明，扫描电镜下微塑料表面的凹坑和细菌的形状相同，并通过对小亚基rRNA的分析发现塑料表面生物被膜中存在烃降解菌。由此可见，微塑料表面附着的微生物可能会降解微塑料。

1 微生物和微塑料相互作用

生物被膜上的沉水表面是微生物群落中微生物选择性依附、易化和种间竞争的结果。塑料的老化过程增加了其可供微生物定殖的表面积，有利于微塑料表面生物被膜的形成，同时，微塑料表面生物被膜的屏蔽作用可能会减缓光照对微塑料的降解作用。此外，微塑料可能会被其生物被膜中的微生物分解[7]。从材料的角度来看，微塑料表面粗糙度[8]、表面形状[9]、表面自由能[10]、表面电荷、静电相互作用[11]、表面疏水性[12]通常被认为是附着过程的相关参数。Lobelle等[13]将聚乙烯(Polyethylene,PE)塑料浸泡在海水中，以研究生物被膜的早期形成过程，研究发现微生物能够在塑料上迅速形成生物被膜并发生生物被膜生长，使得浸没的塑料疏水性下降，从而使细菌更容易在其表面定殖。海洋生态环境中，塑料上生物被膜群落的组成随季节、地理位置和塑料基材类型变化而表现出不同的种群特征[14]。在亨伯河口，Harrison等[15]在三种类型的沿海沉积物中对低密度聚乙烯(Low Density Polyethylene, LDPE)进行为期14 d的微塑料表面附着微生物研究，发现与环境中浮游态细菌相比，微塑料表面生物被膜中的细菌具有特异性，这种细菌的特异性附着可能在海洋沉积物和水体之间有所不同。而且，同游离态细菌和有机物附着的细菌群落相比，微塑料表面的细菌群落具有较多的细胞富集因子，更高的细菌多样性，且有很多是能在生物被膜形成和发育中起重要作用的蓝藻[16]。微塑料表面能够迅速被微生物附着并产生生物被膜，同时新形成的生物被膜又能够能促进更多微生物的附着[17]。Oberbeckmann等[18]对聚苯乙烯(Polystyrene, PS)、 PE两种成分的微塑料和木质颗粒按照从海水(波罗的海沿岸)到淡水(污水处理厂)的环境梯度培养，发现环境中的微生物是生物被膜群落中细菌生长发育的基础。然而，微塑料虽然能特异性富集微生物，但同天然材质富集的微生物种类并未表现出较大差异。此外，Kesy等[19]对PS、PE和天然材料附着的生物被膜进行了研究，其研究表明环境因素对生物被膜的形成具有明显影响，生物被膜附着的材质是否为塑料，以及不同类型的塑料对生物被膜形成并未构成显著影响。微塑料表面生物被膜中的微生物并未表现出同环境中有机质表面的微生物有明显差异，微塑料虽然可以选择性富集生物，但富集的微生物同有机物附着的微生物未表现出明显不同。因此，微塑料表面菌群与微塑料所处的环境高度相关。

此外，微塑料在环境中暴露的时间，对微塑料表面生物被膜中的细菌种群也有较大影响。Xu等[20]采用高通量测序技术，利用聚丙烯(Polypropylene, PP)和聚氯乙烯(Polyvinyl Chloride, PVC)微塑料在中国沿海海水进行为期一年的附着微生物群落演化研究，发现不同地理位置和暴露时间的塑料圈微生物群落组成显著不同，微塑料中的优势菌群隶属于变形菌纲(Alphaproteobacteria)，以红杆菌科(Rhodobacteraceae)居多，其次是伽马变形菌纲(Gammaproteobacteria)，且微塑料表面的生物群落具有多样性特征。Li等[21]在舟山的摘箬山岛用PE和聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene Glycol Terephthalate, PET)研究海洋微塑料中细菌群落的多样性和结构，通过为期3个月的暴露实验，发现微塑料表面形成的生物被膜中细菌组成显著取决于海洋栖息地和暴露时间，而不是微塑料类型，且潮间带的微塑料上细菌丰富度和多样性最高。Sun等[22]对中国桑沟湾海水养殖区的微塑料进行了研究，结果发现微塑料表面的菌群主要来源于周围海水和沉积物，分别对微塑料表面菌群的平均贡献率为47.91%和37.33%，且微塑料表面的菌群与周围海水的细菌相似性随着微塑料在海洋中放置时间的延长而降低。微塑料表面附着生物不仅受到地理位置和暴露时间的影响，不同成分微塑料附着的微生物在生物被膜形成方面也表现出差异性。同其他塑料材质相比，PVC材质的微塑料颗粒在生物被膜形成方面表现出明显的优势，当与其他材料一起形成生物被膜时，PVC表面能够形成更多的生物被膜[23]。

2 生物被膜与微塑料降解

细菌作为自然界中环境适应性最强的生物，对环境有着独特的适应能力，能适应高温、低温和高压环境，且具有多样的代谢方式，如硫化细菌、硝化细菌等。塑料作为一种碳基有机物，可以作为碳源，供细菌自身的生长发育。Habib等[24]将南极土壤中的细菌假单胞菌(Pseudomonassp.)ADL15和红球菌(Rhodococcussp.) ADL36放在含PP微塑料上进行为期40 d的生长和生物降解潜力的研究，根据PP微塑料的失重、每天的去除率常数和半衰期来监测降解情况，利用傅里叶变换红外光谱对PP微塑料的结构变化进行分析，评价其生物降解的有效性，分析表明，PP微塑料在加入南极菌株后官能团发生了显著变化。已有研究表明，生物被膜中的微生物能够分解微塑料。Xu等[20]通过扫描电镜分析证明了微塑料有被微生物降解的迹象，Harrison 等[15]发现LDPE附着生物被膜中存在弓形菌属(Arcobacter) 和科尔韦氏菌属(Colwellia)细菌，这两类菌属都与低温海洋环境中烃类污染物的降解有关。此外，也有报道发现阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)YT1和芽胞杆菌属(Bacillus)细菌能够分解PE[25]。芽胞杆菌属在塑料降解方面表现出良好的特性。Auta等[26]从红树林沉积物中分离出两种芽胞杆菌属细菌，并证明这两种细菌对PE、PP、PS和PET塑料具有良好的分解效率。在中国东海同样发现了以PP为唯一碳源的芽胞杆菌[27]，塑料的生物降解同样发生于微塑料表面的生物被膜中。Li等[21]的研究发现具有塑料降解能力的芽胞杆菌可能存在于微塑料表面的生物被膜中。因此，可以通过加强对芽胞杆菌分解微塑料的研究，为芽胞杆菌对微塑料污染的防治提供科学依据。此外，新加坡海岸的微塑料研究表明，人口聚集区的微塑料中含有更多的细菌，在重航运和重污染地区，红杆菌属(Erythrobacter)等烃类降解细菌占主导地位[28]。这表明微塑料分解菌能够在富含微塑料的环境中取得生长优势，更多的微塑料分解菌可以在微塑料污染严重的地区分离鉴定出来，用于后续塑料分解相关研究。塑料分解菌与可分解的塑料类型如表1所示。

表1 微塑料分解菌与可分解的塑料类型Table 1 Microplastics decomposing bacteria and plastic types that can be decomposed

3 微塑料与致病菌

海洋中存在多种潜在的致病菌，这些潜在致病菌可能会附着于微塑料表面，并在微塑料表面的生物被膜中富集，从而达到“致病浓度”。弧菌是海洋中常见的潜在致病菌，如副溶血性弧菌便是一种条件致病弧菌，其对渔业生产和人体健康均有潜在风险，成为食品安全领域防治的重点。Zettler等[6]通过二代测序技术，在微塑料表面的微生物群落中发现了与弧菌属(Vibrio)相关的基因序列。目前在全球多个水域发现海洋微塑料表面有弧菌附着，如北海和波罗的海的PE、PP和PS等微塑料颗粒上存在潜在致病性副溶血性弧菌[29]，象山港海水养殖网箱中的PET微塑料上也发现弧菌属的存在[30]，桑沟湾海水养殖区域的微塑料也可能是致病性弧菌的富集载体[22]。灿烂弧菌(Vibriosplendidus)是致病性弧菌，能够引起牡蛎大规模死亡，在对布雷斯特湾微塑料表面附着生物的研究中发现，大多数微塑料表面都存在灿烂弧菌[31]，这表明海洋中微塑料表面确实存在致病性弧菌。此外，一些其他的潜在致病菌也在微塑料表面被发现。例如，新加坡海岸的微塑料表面不仅鉴定出了弧菌，还发现有假单胞菌等潜在致病菌的存在[28]，中国东南沿海海水养殖区域微塑料附着的弧菌属和假单胞菌属是该区域微塑料附着微生物的主要潜在病原菌，研究发现夏季微塑料样品表面的生物被膜中弧菌属的含量高达41.03%[32]。可以肯定的是，微塑料表面附着的致病菌可能对海水养殖业产生较高的生态风险，然而，致病菌对生物的致病性，以及微塑料对渔业生产的潜在风险仍需进一步研究。在北亚得里亚海表层水中发现微塑料附着的微生物中存在鱼类致病性细菌杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)，沙门氏菌是鱼类疾病的元凶。因此，研究微塑料附着的沙门氏菌是否会导致鱼类疾病传播及其传播方式具有重要意义[33]。此外，对附着于微塑料、岩石及叶子上的生物被膜的研究发现，只有微塑料生物被膜中存在两种人类致病菌蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)、门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)和一种植物致病菌丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)，而在自然底物上形成的生物被膜中未检测到致病菌。微塑料可以作为微生物的一种新型附着基质，作为病原体从河流进入新环境中的载体，产生生态风险并可能危害人类健康[34]。另对PE和PS微塑料形成生物被膜的研究表明，弧菌可能与细菌早期在微塑料表面定殖有关(图1)。弧菌可能是塑料表面早期生物被膜的形成菌[19]。因此探究微塑料附着致病微生物是否会导致疾病传播以及如何导致疾病传播的答案至关重要[33]。

图1 潜在致病弧菌附着示意图[35]Fig.1 Attaching schematic diagram of potentially pathogenicVibrio[35]

4 微塑料与细菌迁徙

海洋中微塑料表面生物被膜中有大量细菌存在，生物被膜中的细菌中存在潜在致病微生物。与天然材料(如木材、纤维素等)相比，塑料以其稳定的化学性质和难以降解的特性在促进微生物迁徙方面有独特的优势。由于生物被膜能够为生活在其中的微生物提供保护，微塑料表面生物被膜中的微生物能够随着微塑料借助洋流等途径进行远距离扩散。病原菌可能在微塑料表面富集后传播给潜在的宿主，从而引起微生物致病事件。附着于微塑料表面生物被膜中的微生物迁徙，可能导致“微生物生物入侵”事件的发生。微塑料表面的细菌群落是动态的，能够迅速适应其环境的变化。微塑料在为微生物生长提供空间的同时，也可以作为海洋微生物长距离迁移的载体[33]，使得细菌长距离迁徙变成可能。

5 微塑料与细菌耐药性

细菌的耐药性(Antimicrobial resistance)能使细菌对抗生素耐药性增强。耐药细菌的出现，使抗生素在治疗细菌引起的疾病时有效性降低，使人类面临细菌感染用药危机。Yang等利用北太平洋环流中微塑料附着生物的宏基因组数据，研究微生物群落中耐药基因和金属抗性基因的多样性、丰度和共生关系，发现微塑料表面的生物被膜中出现了耐药基因，塑料上的微生物群中耐药基因和金属抗性基因的含量都明显高于海水，塑料尺寸未影响抗性基因的丰度和多样性[36]。微塑料在海洋中的广泛分布，附着于微塑料表面微生物含有耐药基因，可能使得耐药基因在海洋中广泛传播。以外源性的红色荧光的大肠埃希菌为供体菌株，引入绿色荧光宽宿主范围编码的甲氧苄啶抗性的质粒pKJK5，并比较在微塑料上形成生物被膜的菌群与游离态的菌群，研究表明，与游离态细菌相比，微塑料表面的细菌存在更频繁的质粒转移，并且有更多的基因水平转移发生。基因水平转移可显著影响全球范围内水生微生物群落的生态。通过微塑料传播抗生素耐药性，也可能对水生细菌的进化产生深远影响，并对人类健康造成不可忽视的危害[36]。以浙江省嘉兴市的两条城市河流为研究对象，Wang等[37]分析了微塑料的细菌群落和浮游细菌群落的差异性，研究发现微塑料上的细菌群落相对于水体样品的丰度和多样性较低，分类组成明显不同。其表面附着的生物被膜中的细菌基因与人类致病菌基因存在较高相关性，微塑料选择性富集耐药基因。微塑料中整合子-整合酶1和2类基因的相对丰度更高，表明微塑料中存在更高水平的水平基因转移。对海水养殖区微塑料表面耐药菌(antibiotic resistant bacteria，ARB)和多重耐药菌(multi-drug resistant bacteria, MDRB)的研究表明，微塑料样品中耐药菌浓度比海水环境中高100～5 000倍。耐药菌主要为弧菌属、鼠尾菌属(Muricauda)和鲁杰氏菌属(Ruegeria)。微塑料表面多重耐药菌中耐青霉素、磺胺呋唑、红霉素和四环素的比例高于水体中多重耐药菌。作为一种新型的微生物生态位，微塑料可能加剧细菌间的基因水平转移，促进耐药基因在细菌间的传播，促进“超级细菌”出现[38]。

6 展 望

海洋微塑料同微生物相互作用对海洋生态系统具有重要影响：①微塑料表面作为微生物新的栖息地，微塑料和微生物之间存在相互作用。一方面，微生物附着于微塑料表面可以形成生物被膜，使得微塑料同环境隔离，从而延缓微塑料在物理、化学作用下的分解；另一方面，附着于微塑料的微生物可能分解微塑料，从而减少海洋中的微塑料。②微塑料成为潜在的致病菌传播源。由于微塑料疏水等特性，能够促进微生物的定殖，可能使得潜在的致病菌在其上定殖，从而使其达到“致病浓度”。③存在较长半衰期的微塑料，可以使附着微生物在生物被膜的保护下持久稳定生存，借助洋流的作用，微生物可以进行远距离迁徙，从而引起可能的“微生物入侵事件”。④微塑料表面附着的细菌之间的基因水平转移，使耐药基因在细菌间传播，从而使更多细菌变成耐药菌，致使防治细菌引起的疾病变得困难。

细菌附着于微塑料表面，借助洋流能够在海洋中进行长距离输运，微塑料较长的生命周期促进了细菌在海洋生态环境中的传播，由此引发的潜在风险目前仍未有详尽的研究。对于微塑料引起的微生物迁徙；致病菌及病毒在迁徙中对环境造成何种影响，尤其是人类致病菌和对渔业生产形成危害的致病菌能造成的危害也未有详尽研究。微塑料表面生物被膜中的细菌间存在频繁的基因水平转移，由于微塑料在环境中难以降解，在微塑料表面发生的细菌间的基因水平转移比在生物基质表面更持久。可能使耐药基因在微塑料表面细菌间广泛传播。此外，“超级细菌”的出现，对目前以抗生素治疗细菌感染的医疗方式提出了挑战。海洋中微塑料表面耐药基因的出现及生物被膜中频繁的基因水平转移，对“超级细菌”的出现可能起促进作用。未来，对微塑料与耐药基因，应以审慎的态度做更多的相关研究，以应对其可能引起的风险。