酱香白酒酿造轮次醇甜典型体基酒风味解析

熊小月，李利利，马宇，黄永光*，尤小龙，程平言

1(贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳，550025)2(六盘水师范学院，贵州 六盘水，553004)3(贵州茅台酒厂(集团)习酒有限责任公司，贵州 习水，564622)

酱香型白酒作为我国传统四大香型白酒之一，经独特的“2次投粮、9次蒸煮、8次发酵、7次取酒”酿酒工艺，其风味较为独特。早在1965年，行业内就通过感官品鉴将酱香白酒基酒分为“酱香、醇甜、窖底香”3种典型体[1]。具有似酱油风味特征的酒称为“酱香”典型体基酒，多产生于窖面糟发酵酒醅；由窖池最底部靠近窖底酒醅蒸馏而得，己酸乙酯风味较重的基酒称为“窖底香”典型体基酒；由窖池中部发酵酒醅蒸馏而得的基酒，酒体醇甜协调，称为“醇甜”典型体基酒[2]。酱香成品酒由3种典型体基酒酒样勾调而成，目前对于3种典型体基酒的研究局限于感官评价，其风味化合物组成、特征风味组分及风味模块结构差异鲜有报道。

酒体风味是评价白酒品质的重要指标，解析酱香白酒风味成分一直是酒类风味化学领域研究的热点[3]。近年来，对酱香型白酒风味的研究较多[4]，NIU等[5]用气相色谱-嗅觉法、香气强度、嗅觉阈值和气味活性值对茅台酒中酯类物质进行全面解析，其中基于风味稀释值和香气活力值(odor activity value，OAV)的13种化合物被认为是重要的香气化合物；ZHAO等[6]采用Sephadex LH-20柱层析和高效液相色谱法从酱香型白酒中分离纯化了1种焦糊香气化合物。但现有研究大多都集中于酱香白酒、成品酒的风味，对3种典型体的研究不足[7-8]：马宇[7]系统解析传统酱香型白酒的3种典型体基酒风味化合物，发现醇甜基酒中OAV>1的物质有25种，对酱香型白酒整体香气有重要贡献作用；李利利等[8]利用液液萃取结合气相色谱-质谱法(liquid liquid extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，LLE-GC-MS)及保留指数法，对酿造轮次酱香典型体进行了风味结构解析，并分析了其特征风味。针对酱香白酒醇甜典型体的风味结构特征的相关研究尚处于空白阶段。

酱香型白酒醇甜典型体不仅有呈甜味的作用，还对酱香型白酒的香味香气具有缓冲作用，对其整体风味的形成十分重要[1-2]。为充分认识酱香白酒风味化合物结构及其风味特征，进一步揭示各轮次醇甜典型体基酒间的差异性，本研究以贵州XJ公司酱香型白酒中轮次醇甜典型体基础酒为对象，采用LLE-GC-MS结合OAV分析其主要挥发性风味化合物，研究酱香型白酒轮次醇甜典型体基酒的风味成分结构特征，以助推我国赤水河流域酱香白酒产业基地建设及发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

贵州XJ公司2017—2018年度四车间生产过程中的轮次醇甜典型体酒基酒(盘勾后综合酒样)，1～7轮次醇甜酒样各1 L。具体酒样信息见表1。

表1 不同生产轮次醇甜典型体基酒样品Table 1 Samples of alcohol-sweetness typical body base Baijiu in different production rounds

2-辛醇(色谱级)、C7～C40正构烷烃，美国Sigma-Aldrich公司；无水Na2SO4、无水乙醚、浓硫酸、NaCl、NaHCO3、乙酸乙酯、戊酸乙酯、2-丁醇、丙醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、庚酸乙酯、1-戊醇、正丁醇、异戊醇、辛酸乙酯、正己醇、癸酸乙酯、正辛醇、2,3-丁二醇、丁二酸二乙酯、乙酸、丙酸、十四烷酸乙酯、苯酚、丁酸、十五烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、苯甲醛、苯乙醇、油酸乙酯、糠醛、2-乙酰基-5-甲基呋喃、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、己酸、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯丙酸乙酯、四甲基吡嗪、4-乙基苯酚、乙醛、3-羟基-2-丁酮，上海国药集团；正己烷(色谱纯)，德国Meker公司；实验中所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GC 7890-5975 MSD型GC-MS联用仪、DB-FFAP毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Agilent公司；MPS2型多功能自动进样系统，德国Gerstel公司；Aquaplore3S超纯水系统，美国艾科浦公司；OA-SYS型氮吹仪，上海安谱科学仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 LLE-GC-MS分析酱香型白酒轮次醇甜典型体基酒风味成分

参照马宇[7]的方法，用超纯水将150 mL酒样稀释至乙醇体积分数为13%，加100 μL内标(2-辛醇)，加入NaCl饱和。用体积分数20%的盐酸调节样品pH至2，用60 mL乙醚分3次萃取，静置分层后合并有机相得到酸性组分。水相用100 g/L NaOH溶液调节pH至12，用60 mL乙醚分3次萃取，静置分层后合并有机相得碱性组分。余下水相调节pH至7，用60 mL乙醚分3次提取，合并萃取液得到中性组分。分别添加过量无水Na2SO4至3个组分中，并置于-20 ℃下过夜干燥，氮吹浓缩至1.5 mL，最终进样量为1 μL，待下一步检测分析。

GC条件：色谱柱初温40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升温到100 ℃，再以4 ℃/min升温至220 ℃，维持5 min。进样口温度250 ℃，不分流进样，载气He(纯度≥99.999%)，流速2.0 mL/min。

MS条件：电离方式EI，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；扫描范围m/z35～350。

1.3.2 定性定量分析

利用NIST11a.L谱库检索并结合保留指数(retention index，RI)对未知化合物定性，其中RI的计算方法参照改进后的Kovats方法[9]计算。

本研究中有标样的化合物用外标法定量，无标样的化合物采用内标法定量。标准曲线法定量：以体积分数为13%的乙醇溶液为溶剂配制待测物标准液，并进行梯度稀释，分析条件与酒样分析条件相同。采用选择离子法计算各化合物的峰面积，以化合物与内标物的峰面积比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标，建立相关物质标准曲线，进行全定量分析。内标法定量：通过计算内标物(2-辛醇)的峰面积和样品中各组分的峰面积比值，从而定量出各个风味成分的含量，进行半定量分析。

1.3.3 感官分析

参考孙优兰等[10]的方法，酒体风味感官品评小组由11人组成(5名男性和6名女性)，均通过良好的白酒品评专业培训，其中1名国家级评委、3名省级评委。先对样品进行多次重复品评，描述出尽可能多的感官香气属性，再经重复筛定，最终确定感官属性为似酱油香、焦糖香、水果香、花香、醇香、甜香、糟香和焦糊香。根据感官定量描述分析方法构建系列酒风味轮廓分析图，单项属性评定分值设定范围为0～5分，其中0分代表没有香气强度，5分代表香气极强。

1.4 数据统计与分析

香气活力分析参考文献[11]的方法计算OAV。

采用Excel 2010对数据进行计算，使用Cytoscape绘制关系网络图，使用R语言绘制热图，Simca14.0绘制偏最小二乘回归(partial least squares regression，PLSR)图，Origin 2018绘制雷达图和堆积柱状图。

2 结果与讨论

2.1 各轮次醇甜典型体基酒风味化合物组成

采用前述LLE方法，对酿造不同轮次醇甜典型体基酒样品进行前处理，分酸性、碱性、中性3个组分，分离后进样分析。从7个轮次醇甜典型体基酒中共检出主要挥发性风味化合物185种，其中芳香族26种、酯类50种、醇类51种、呋喃类9种、吡嗪类11种、酸类22种、醛及缩醛4种和酮类12种。对各轮次检出的主要挥发性化合物种类及含量进行对比分析，如图1所示。

图1 醇甜典型体基酒风味化合物含量及风味化合物种类变化趋势Fig.1 Flavor compound content and variation trend of flavor compounds in alcohol-sweetness typical body base Baijiu

各轮次醇甜典型体基酒中，酯类、醇类、酸类占各酒样检出风味化合物总含量的65%以上，在酒样风味组成中占主导地位，与王晓欣[12]对酱香、浓香型白酒的研究结论基本一致。从检出结果看，主要酯类物质在1～7轮次间具有相同变化趋势，其在1～7轮次酒样的总含量依次为1 103.14(J1)、1 174.14(J2)、1 036.75(J3)、842.88(J4)、1 483.44(J5)、1 239.29(J6)、790.06(J7) mg/L，其中5、6轮次的含量较高，其他轮次间无显著差异。醇类化合物在1～7轮次的总含量分别为415.16(J1)、548.56(J2)、381.68(J3)、729.85(J4)、1469.70(J5)、1027.29(J6)和245.30(J7) mg/L，其在4、5、6轮次样品中含量最高，而在7轮次的含量最低。酸类化合物在1～7轮次的含量分别为495.97(J1)、441.19(J2)、368.02(J3)、546.14(J4)、966.76(J5)、1 682.27(J6)和457.18(J7) mg/L，其中除3轮次外，在轮次间呈现逐渐增加趋势；在6轮次含量骤增，这主要源于乙酸、异丁酸、丁酸在6轮次含量较高所致，在7轮次含量降低，与1、2轮次相近。

除此之外，芳香族化合物相对于其他微量成分的含量也较高，在6轮次中的含量最高(872.47 mg/L)，1～5轮次的含量均在150～320 mg/L，7轮次的含量最低(17.37 mg/L)。整体来看，轮次醇甜典型体基酒风味化合物组成差异较大，但种类和含量总体均是先上升后下降、再上升、再下降的变化趋势，这与酱香典型体轮次基酒中种类与含量的变化趋势一致[13]。同时，对比杨大金等[14]和马宇[7]的研究结果发现，轮次综合样基酒风味物质的种类与含量主要是在2、4、5轮次较高，而醇甜典型体主要是在5、6轮次含量较高，体现出了醇甜典型体基酒的特点。

2.2 各轮次醇甜典型体基酒主要挥发性化合物

为更好研究各类主要风味化合物含量的变化特征，对各组分化合物中含量与阈值较高的物质按其含量变化做热图(共102种)，其中酯类31种，醇类22种，酸类13种，芳香族14种，呋喃吡嗪12种，酮类10种(图2)。

图2 轮次醇甜典型体基酒风味化合物热图Fig.2 Heatmap of the flavoring compounds of the alcohol-sweetness typical body base Baijiu in different rounds

酯类物质是白酒中重要的呈香物质，是构成酒体的香味成分和特殊风味的主要基础物质[15]。结合图2中的酯类，发现在7个轮次中均检出的酯类物质有12种，包括亚油酸乙酯(40～350 mg/L)、乙酸乙酯(1～25 mg/L)、乳酸乙酯(50～300 mg/L)，丁二酸二乙酯(1～100 mg/L)、十六酸乙酯(80～360 mg/L)、油酸乙酯(100～420 mg/L)等。在这12种酯类化合物中有9种是高级脂肪酸乙酯，这些酯类(亚油酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、硬酯酸乙酯等)与NIU等[5]对酱香白酒成品酒中的酯类化合物研究结论有较大差异，即在成品酒中同一类高级脂肪酸乙酯的含量(10～50 mg/L)远低于醇甜典型体基酒，这可能是成品酒勾调时选取了高级脂肪酸乙酯含量很低的组合基酒，形成了低含量高级脂肪酸乙酯的产品酒。同时，这些酯类物质在3～6轮次中含量较高，这与马宇[7]对传统酱香白酒醇甜基酒中酯类化合物的变化趋势研究结论一致，在3轮次之后，随着淀粉利用率提高，微生物生长越来越丰富，风味化合物含量也随之升高。孙优兰等[10]对清酱香型白酒风味特征的研究中也发现，系列酒中酱香风味越明显的样品其高级脂肪酸乙酯含量越高。白酒中高级脂肪酸乙酯具有呈香、呈味作用，可延长白酒的后味，增添酒体的丰满感[15]。所以，高级脂肪酸乙酯含量的变化和差异性可能是影响成品酒、轮次酒与醇甜典型体风味结构差异的重要因素之一，其具体机制仍然需要进一步研究。

醇类是形成酒体爽口性的重要成分，适量的高级醇可增加酒体的甜度和醇厚感，特别是一些特征性醇类化合物。在7个轮次中均检出的醇类物质有8种，除乙醇外，丙醇(14～170 mg/L)、异丁醇(10～90 mg/L)、正丁醇(15～200 mg/L)、异戊醇(2～230 mg/L)等醇类物质在醇甜典型体基酒中含量较高。结合图2对比分析发现，正丙醇在1、6、7轮次含量较高，2～5轮次含量较低，这与杨大金等[14]对轮次基酒研究一致。1、6、7轮次微生物可利用糖分低，微生物通过氨基酸代谢生成正丙醇，正丙醇的含量增多，会导致酒体较苦涩，与酱香轮次醇甜典型体基酒感官品评结果一致。异丁醇与正丁醇在1、7轮次含量较低，而在其他几个轮次含量较高，但轮次间的整体差异较小。正辛醇、正壬醇、2-糠醛缩二乙醇、正戊醇、2-庚醇等在3、4、5轮次中检出含量较多。2,3-丁二醇在1、4轮次检出，在4轮次检出较高(15.97 mg/L)，研究表明2,3-丁二醇能促进一些与酱香有关物质的增加[16]，与4轮次酱香风味明显可能有较大联系，需进一步研究。同时，在白酒中醇类化合物含量越高，其香气与醇甜感越好[17]。

酸类化合物是白酒中的重要风味物质，其在酒中有缓冲平衡、助香和呈味等作用，同时可催化酒体老熟，尤其是一些重要的酸类化合物可以使酒体趋于醇厚、绵柔，提升白酒的丰满度和醇和度，消除白酒的糙辣感[18-19]。在1～7个轮次醇甜典型体基酒中均检出乙酸、异丁酸、丁酸。其中，乙酸在1轮次的含量较高，2、3轮次开始降低，之后随着轮次增加含量相应增多，在6轮次达到最大(518.66 mg/L)，这是由于发酵前期细菌大量繁殖代谢产酸，随后细菌减少酸含量略有下降，发酵一定时间后细菌数量增加进一步产酸，从而乙酸增多[19]。异丁酸(40～210 mg/L)与丁酸(40～230 mg/L)在1～6轮次含量逐渐增加，在6轮次达到最高。除了上述3种酸类物质外，丙酸以及棕榈酸均在6轮次中含量较高。己酸在1轮次未检出，在2～6轮次含量(16～170 mg/L)不断增加，在7轮次降低为15 mg/L。2-甲基己酸只在4轮次醇甜典型体中检出，且含量较高(196.54 mg/L)。由此看出，酸类物质主要是在4、5、6轮次含量高，这与各轮次间醇甜典型体基酒口感风味差异关联度较大，可对每个轮次风味进行感官描述分析，再结合实际数据，具体分析各酸类物质对酒体的主要贡献。

芳香族化合物具有香气突出、香味强度大、香气保留时间长等特点，赋予酒体优雅、醇厚的风味、风格[20]。在1～7个轮次醇甜典型体基酒中均检出5种，其中有呈浓烈香甜的蜂蜜香气的苯乙酸乙酯(119.68 mg/L)与呈花香、水果香的乙酸苯乙酯(92.79 mg/L)均是在6轮次中含量最高，在其他几个轮次的含量差异较小；呈玫瑰香、水果香、蜜香的苯乙醇在7个轮次醇甜典型体基酒中整体含量较高，在1～6轮次中不断增加，在6轮次达到最高(330.27 mg/L)。而呈烟熏味的酚类物质，主要以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚含量较高，其在6轮次含量最高(65.85 mg/L)，其他几个轮次差异较小；其他酚类物质只在1、2轮次中检出，这与实际生产中1、2轮次带少许烟熏味、苦味风味相吻合，这类物质的出现可能与酱香白酒生产丢糟、微生物结构密切相关。在对芳香族化合物分析过程发现，除酚类物质主要是在1、2轮次中检出外，其他呈香物质在各轮次间都均有不同分布，且大多数都是在6轮次含量最高，这与6轮次醇甜典型体基酒的风味强度较大有关。

呋喃、吡嗪类化合物大多呈烘培香、焦香且是酱香白酒中的重要风味。早在1981年，有研究者提出呋喃、吡嗪类化合物和可能与酱香型风味有关[21]，后证实吡嗪并不能直接贡献酱香香气，但吡嗪类化合物仍然是酱香型白酒的重要特征成分[22]。从1～7轮次醇甜典型体中共检出呋喃9种、吡嗪11种，在每个轮次中的总含量相对上述4类物质较低。呋喃类的含量在35～230 mg/L，2、5轮次含量最高(约200 mg/L)，3、4、6轮次含量也较高(>100 mg/L)。在2～5轮次中糠醛含量在110～200 mg/L，占呋喃类总含量的80%以上，是酱香白酒中的重要呈焦香类物质。而呈烘培香、烤玉米香、坚果香的大多是吡嗪类物质，其在7个轮次醇甜典型体基酒整体含量较低。同时，在7个轮次醇甜典型体中均检出4种吡嗪物质：2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪，其在1～6轮次中随着生产原料利用率提高，含量逐渐增加，在6轮次含量达到最高，而在7轮次稍降低；并且这4种吡嗪类物质与酱香白酒中5～7轮次的烘培香、焦香有直接联系。以四甲基吡嗪为代表的含氮类化合物被认为是酱香型白酒的特征性风味成分[23]，本研究中四甲基吡嗪只在1、2、6轮次醇甜典型体基酒中检出，6轮次含量较高(8.21 mg/L)，与韩兴林等[24]对传统方式酿造的酱香轮次基酒的研究结论有所差异，这可能是由于测定样品不同所致。

其他类化合物主要包括醛酮类化合物，如5-甲基呋喃醛在7个轮次醇甜典型中均有检出，在3～7轮次含量较高，在1、2轮次含量较低；呈黄油味、酸奶味的3-羟基-2-丁酮在7个轮次醇甜典型体基酒中均有检出，在2、3轮次含量较高，5、6轮次含量约为2.5 mg/L，稍低于前两轮次，与轮次基酒中的变化趋势较为相似[13]，其存在于乳品和水果中，具有令人愉快的香气[24]。

2.3 酿造醇甜典型体基酒各轮次特征化合物及其轮次间的差异

为了进一步探索1～7各轮次酱香白酒醇甜典型体基酒的特征化合物，对重要风味化合物进行全定量分析，并对这些化合物进行OAV计算、统计分析，将所得OAV>1的化合物与其轮次作关系网络图与同类呈香化合物OAV进行均值化处理作风味雷达图，同时采用PLSR法建立模型探索轮次醇甜典型体基酒的感官属性与其特征香气化合物之间的关联，结果如图3所示。

a-OAV关系网络图(浅黄色节点代表轮次，外部节点代表香气化合物，不同的颜色代表不同香气化合物的类别，节点大小与关联香气化合物的数量有关)； b-感官属性与重要香气化合物PLSR图； c-风味物质OAV雷达图； d-感官属性风味雷达图图3 轮次醇甜典型体基酒感官属性及特征挥发性风味化合物解析Fig.3 Analysis of sensory attributes and characteristic volatile flavor compounds of the alcohol-sweetness typical body base Baijiu in different rounds

汇总分析结果表明，在酿造轮次醇甜典型体基酒中OAV>1的主要挥发性风味化合物有40种，其中醇类8种、酸类6种、酯类13种、呋喃吡嗪5种、芳香族6种以及醛酮各1种，其在酒体中的定性定量结果详见电子版增强出版附表。从图3-a可知，7个轮次中，3、4、5轮次醇甜基酒的贡献性风味化合物较相似，6轮次中贡献风味的化合物略多于1～5轮次，1轮次基酒中贡献风味的化合物多于2、3轮次，这主要源于酱香白酒酿造的下造沙工艺及其酿造原料的利用差异化所致。进一步分析各轮次主要挥发性化合物的呈香贡献特征，将其分为6个模块，并根据各轮次呈现不同风味模块OAV大小作风味雷达图分析。由图3-c可知，似酱香(烘培香、坚果香、奶酪香)、焦糖香等特征香在醇甜典型体各轮次基酒中均有体现，1、2轮次香气变化一致，且花香风味较为突出；3～5轮次变化一致，似酱香与水果香OAV高于其他香气，酒体酱香、果香及其复合香优雅；而6轮次中似酱香风味OAV均低于3～5轮次，焦糖香、甜香OAV较高；7轮次中各香气OAV均较低。

在此基础上，采用PLSR方法建立模型，其中X代表白酒的香气化合物变量；Y代表感官变量和样本，其相关分析载荷图结果见图3-b。轮次醇甜典型体基酒风味存在明显差异，从感官分析，沿PC2轴以似酱油香、水果香、花香、甜香、焦糖香为主，均分布在载荷图上方；而糟香、焦糊香分布在下方。其中，J1、J2、J7分布在三象限与糟香有良好的相关性，而J3、J4、J5分布在一二象限与似酱油香、水果香、花香具有良好相关性。J6主要分布在第四象限与焦糊香、焦糖香、甜香、似酱油香气有良好相关性。图3-d感官品评结果发现，两者有较好的关联性。在醇甜典型体基酒中，1～7轮次均有醇香，1、2轮次糟香较突出，3、4、5轮次似酱油香、花香、水果香较好，6轮次中除了有较好的似酱香、花香、水果香外，焦糊香与焦糖香均较突出，7轮次中，除焦糊香较突出外，各香气均减弱。

3 结论

本研究以酱香型白酒酿造1～7轮次的醇甜典型体基酒为研究对象，应用LLE-GC-MS对1～7轮次醇甜典型体基酒进行定性定量分析，同时对检出主要挥发性化合物进行OAV计算、分析，总结出各个轮次醇甜典型体的风味特征。结合OAV筛选与感官品评，醇甜典型体酒的风格特征是以酱香为主，醇香、水果香、花香为辅的复杂香气的酒体，其中3、4、5轮次醇甜典型体基酒中以酱香、水果香、花香为主；6轮次除似酱油香、水果香等突出外，焦糖香较好；1、2轮次中糟香较为突出；7轮次中除焦糊香突出外，糟香味也较重。对1～7个轮次醇甜典型体基酒风味具有主要贡献的成分有9种，具体为十四酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、糠醇、糠醛、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3-羟基-2-丁酮；对3、4、5轮次具有风味贡献的化合物除上述9种外，还有戊酸乙酯、乙酸戊酯、辛酸乙酯、2,3-丁二醇、正壬醇、丁酸、异戊酸、苯乙酸乙酯、正己酸乙酯和3-苯丙酸乙酯；除此之外，6轮次还有苯乙醛、苯乙酸乙酯贡献也较大；1、2轮次除基本香气化合物外，较为突出的成分有：3-苯丙酸乙酯、苯乙酸乙酯；7轮次主要以前述9种主要贡献性成分为主，其中呈焦糊香的吡嗪类在7轮次中OAV较大，香气贡献较高。