miR-210 介导CH25H 免疫信号通路调控骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡新机制研究①

吴福顺 宋 瑶 张 雪 金京春 （延边大学附属医院免疫科，延边 133000）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种与年龄相关的退行性疾病，主要表现为软骨组织遭到破坏、滑膜炎症、骨赘形成等，同时伴有疼痛、短暂晨僵和骨擦音等临床症状，严重影响患者生活和工作［1］。目前研究表明骨关节形成由多因素导致，microRNAs（miRNAs）在多种疾病中均发挥重要生理调控作用，其在OA 发生发展过程中既有上调表达又有下调表达，最新一项研究已经证实miRNA-138-5p可促进软骨细胞增殖改善OA 炎症环境［2］。OA 同时由免疫信号调节失衡造成大量炎症因子分泌所导致［3］。miR-210已被证实有调控细胞增殖作用，但其是否通过调控免疫相关信号通路发挥抗炎促增殖作用鲜有报道。本研究旨在明确miR-210 对OA 软骨细胞增殖和凋亡调控的新机制。

1 材料与方法

1.1 材料 12 只10 周龄SD 雄性大鼠购自延边大学实验动物中心；0.25%胰酶（03-052-1A/B）购自Biological 公司；0.2%Ⅱ型胶原酶混合液（BJ-X0541）购自邦景公司；胎牛血清（F8318）、DMEM（D6429）购自Sigma公司；Weigert染液（JA1021）、番红O染液（JA1987）购自佳维斯公司；IL-6（ab233706）、MMP-3（ab285407）、CH25H（ab214295）、山 羊 抗 兔IgG（ab150077）、DAB（ab64238）购自Abcam 公司；TRIzol（15596026）、氯仿（10296028）购自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 12 只SD 大鼠随机分为sham 组和OA 组，每组6 只。所有大鼠均饲养于23 ℃、相对湿度55%、噪音85 分贝以下环境中，每12 h 通风换气1 次。每天加水2 次，每天更换1 次垫料，室内光线阴暗。所有大鼠均按照延边大学动物伦理委员会要求规范饲养和操作。

1.2.2 Hulth 法构建OA 大鼠模型 3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉大鼠，后肢膝关节处采用Hulth 法造模［4］。具体步骤：OA组大鼠后肢两侧切开2 cm左右切口，剥离并切断交叉韧带和内侧副韧带，剥离整个半月板，不损伤膝关节软骨面，随后缝合消毒。sham 组大鼠仅进行皮肤切开术后立即缝合。术后均注射青霉素抗感染，连续注射3 d，分笼单独饲养。

1.2.3 分离原代软骨细胞 取大鼠后肢膝关节消毒，超净台内剪碎膝关节软骨，采用含0.25%胰酶和0.2%Ⅱ型胶原酶混合液玻璃皿内消化4 h。无菌滤网过滤，4 ℃、1 000 r/min 离心5 min，采用含10%胎牛血清的DMEM 培养液重悬，细胞培养箱内培养，观察细胞生长状态。

1.2.4 HE染色 取SD大鼠后肢关节脱钙处理，石蜡包埋，切片，脱蜡，苏木素染色10 min，0.7%盐酸乙醇分化5 s；去离子水洗片、氨水处理后水洗，伊红染色5 min，水洗，乙醇、二甲苯处理，烘干树脂封片。

1.2.5 番红O-固绿染色 取SD 大鼠后肢关节脱钙处理，石蜡包埋，切片后脱蜡。Weigert 染液染色5 min，酸性乙醇分化液分化15 s，洗片后固绿染液染色5 min，洗片，番红O染液染色2 min，洗片、乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片。

1.2.6 免疫荧光 将软骨细胞铺至含0.1%胶原涂层的玻璃盖玻片，待细胞密度达60%左右采用预冷的甲醇和丙酮混合液（1∶1）进行固定，1%TritonX-100/PBS 中透化，洗片擦干后加入IL-6 和MMP-3（1∶1 000）抗体4 ℃孵育过夜。次日4%多聚甲醛固定4 h，含15%蔗糖的PBS孵育4 h，去离子水清洗玻片，激光共聚焦扫描分析切片。

1.2.7 CCK-8检测细胞增殖 细胞按5 000个/孔接种至96孔板，设3个复孔。sh-miR-210、NC-miR-210、mimics-miR-210 Lipofectamine3000 转染软骨细胞成功后，分别在0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 时20µl/孔加入CCK-8反应液37 ℃孵育2 h，酶标仪测定450 nm处吸光度。

1.2.8 流式细胞术 按照1.2.7转染细胞。软骨细胞接种至6 孔板，细胞密度生长至60%左右收集细胞，加入5µl Annexin V-FITC 避光孵育10 min，再加入10µl碘化丙啶染液避光孵育15 min，流式细胞仪分析。

1.2.9 免疫组化 关节脱钙处理，石蜡切片脱蜡至水，修复抗原，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，加入CH25H一抗、二抗，DAB显色，细胞核复染，脱水，切片扫描仪扫描分析。

1.2.10 RT-PCR 采用TRIzol和氯仿用提取RNA，RNA 逆转录试剂盒将RNA 逆转录为性质稳定的cDNA，qRT-PCR仪检测目的基因相对表达，以β-actin为内参。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃退化10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s。2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.11 Western blot 调整细胞密度为5×104个/ml，细胞汇合度达70%时收集细胞，冰上裂解30 min，4 ℃、8 000 g 离心吸取上清，提取总蛋白，蛋白定量后计算，加入上样缓冲液，100 ℃煮5 min，SDS-PACE凝胶电泳，电泳结束后将目的蛋白转至PVDF 膜，脱脂牛奶封闭，加入IL-6、MMP-13 和CH25H 一抗孵育过夜，次日加入二抗孵育，PBS 清洗，ECL 发光仪发光拍照。

1.3 统计学分析 数据应用SPSS20.0软件进计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-210 在OA 体内外模型中表达下调 HE染色结果显示，与sham 组相比，OA 组大鼠软骨细胞显著肥大且排列无序（图1A）；番红O-固绿染色结果显示，OA 组大鼠软骨组织出现明显骨侵蚀（图1A）。免疫荧光鉴定软骨细胞标志物Ⅱ型胶原表达，结果显示，软骨细胞胞浆和胞膜处分布Ⅱ型胶原（P＜0.05，图1B）。RT-PCR 结果显示，OA 组大鼠软骨组织和IL-1β 的刺激软骨细胞内miR-210 表达均显著降低（P＜0.05，图1C、D）。体内外实验结果均提示miR-210与OA密切相关。

图1 大鼠软骨组织染色及miR-210表达Fig.1 Staining of cartilage and miR-210 expression of rats

2.2 miR-210 促进软骨细胞增殖 sh-miR-210、NC-miR-210 和mimics-miR-210 分别转染软骨细胞，RT-PCR 结果显示，sh-miR-210 显著降低软骨细胞miR-210 表达，mimics-miR-210 显著增加软骨细胞miR-210 表达（P＜0.05，图2A）；CCK-8 结果显示，软骨细胞增殖能力随着miR-210 表达沉默而降低，随着miR-210 过表达而增强（P＜0.05，图2B）；细胞凋亡趋势则与之相反（P＜0.05，图2C）。

图2 miR-210对大鼠软骨细胞增殖的影响Fig.2 Effects of miR-210 on proliferation of chondrosto⁃cytes of rats

2.3 miR-210 抑制免疫细胞因子IL-6 和MMP-13 表达 免疫荧光结果显示，IL-6 和MMP-13 在IL-1β 刺激的软骨细胞内表达均显著增加，mimics-miR-210转染后可抑制软骨细胞IL-6 和MMP-13 表达，sh-miR-210 显著增加IL-6 和MMP-13 表达（P＜0.05，图3A、B）；RT-PCR 和Western blot 结果提示IL-6 和MMP-13 在OA 模型组软骨组织中显著增高（P＜0.05，图3C、D）。提示miR-210 通过抑制细胞因子IL-6和MMP-13表达对OA软骨细胞发挥保护作用。

图3 miR-210对大鼠软骨细胞IL-6和MMP-13表达的影响Fig.3 Effects of miR-210 on IL-6 and MMP-13 expressions in chondrocyte of rats

2.4 miR-210 抑制软骨细胞CH25H 表达 CH25H可导致代谢紊乱参与OA 发生，Western blot 证实CH25H 在IL-1β 刺激的软骨细胞内表达显著增高（P＜0.05，图4A）；Western blot（图4A、B）和RT-PCR（图4C）结果显示，CH25H 表达随着miR-210 沉默而增加，随着miR-210 过表达而降低（P＜0.05）。提示CH25H在OA发生过程中受miR-210调控。

图4 miR-210对大鼠软骨细胞CH25H蛋白表达的影响Fig.4 Effects of miR-210 on CH25H protein expression in chondrocyte of rats

2.5 CH25H 部分抵消miR-210 对软骨细胞的促增殖作用 为探索CH25H作用于miR-210的位置，采用IL-1β 刺激软骨细胞，随后共同转染mimics-miR-210和CH25H 过表达质粒，结果发现miR-210 对软骨细胞的促增殖作用被部分抵消（P＜0.05，图5A）；共同转染sh-miR-210和shRNA-CH25H质粒后，sh-miR-210抑制细胞增殖的作用可被shRNA-CH25H 部分恢复（P＜0.05，图5B）。

图5 CH25H 可部分抵消miR-210 对大鼠软骨细胞增殖能力的影响Fig.5 CH25H partially counteracts effect of miR-210 on proliferation capacity of chondrocytes of rats

3 讨论

软骨细胞是软骨组织中维持关节软骨稳态的重要因素，研究证实软骨细胞大量凋亡和免疫因子异常表达是OA 发生的重要因素［5］。OA 是老年人常见的一类骨科疾病，同时好发于运动员等运动量大导致关节损伤的人群［6］。研究报道mRNA 在多种细胞调控过程中发挥重要作用，同时参与OA 发生发展，但其具体调控机制尚不明确［7］。mRNA 通过调控细胞增殖分化和凋亡等作用参与多种疾病发生发展，是治疗多种疾病的热门候选靶点［8］。大量研究证实，多种mRNA参与OA发生过程，如miR-31-5p在OA 患者外周血中表达显著增高，体外实验表明miR-31-5p 对软骨细胞增殖和分化起负调控作用，说明miR-31-5p 可促进OA 发生［9］。此外，miR-495通过抑制PI3K/AKT 信号通路促进软骨细胞凋亡和老化而发挥促OA 发生作用，同时miR-27a 在OA 中的表达与上述mRNA 相反，呈下降趋势，体外实验证实增加miR-27a 表达可促进软骨细胞增殖，抑制其凋亡［10-12］。提示mRNA 在OA 发生发展过程中发挥重要作用。

本研究发现miR-210 在OA 大鼠关节软骨组织和IL-1β 诱导的体外软骨细胞中表达均显著降低。miR-210 已被证实对多种细胞起促增殖作用，但其对软骨细胞增殖的影响如何尚不清楚。本研究通过增殖活力实验和流式检测观察转染sh-miR-210、mimics-miR-210 对软骨细胞增殖和凋亡能力的影响，发现软骨细胞增殖能力随着miR-210 表达沉默而降低，随着miR-210过表达而增强。IL-6和MMP-13是促进OA 发生的免疫细胞因子，在OA 中大量分泌和表达［13］。本研究发现，miR-210 能够显著降低OA标志细胞因子IL-6和MMP-13表达，证实miR-210参与OA 发生并发挥负调控作用，但并未明确其具体作用方式。进一步查阅文献发现，CH25H 是参与OA 发生的经典免疫因子，可通过影响CH25HCYP7B1-RORα信号轴调控OA代谢，诱发OA［14］。

CH25H 是一类重要免疫调控因子，在多种疾病中异常表达可导致患者机体代谢紊乱，为疾病发生提供有利条件［15］。在风湿性关节炎中，CH25H 促进重要免疫因子IL-1β/TNF-α/IL-6 表达，导致患者代谢紊乱，促进风湿性关节炎发生发展［16］。免疫因素对OA 同样重要。本研究显示，miR-210 显著抑制CH25H在体外软骨细胞中表达，同时过表达CH25H可部分抵消miR-210 对软骨细胞的促增殖作用，说明二者相互作用，但具体机制尚不清楚，将是下一步研究重点。

综上所述，本研究明确miR-210在OA 体内模型中表达显著下调，可能通过促进软骨细胞增殖对OA 发生起促进作用，进一步发现miR-210 可能通过抑制免疫因子CH25H 发挥促软骨细胞增殖作用。以上结果初步探讨了miR-210 在OA 发生中起重要作用，为下一步研究奠定基础，同时为OA 发病机制提供了新的理论依据。