槲皮素对产肠毒素大肠杆菌转录组的影响

李井贺，李 淼，石海涛，黎 江，谭跃荣，苏广旭，彭璐媛，申海清，付本懂，伊鹏霏 (吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是一种重要的人兽共患病病原菌，临床主要症状是引起腹泻，情况严重时可导致死亡，严重威胁生命健康，造成重大经济损失[1]。ETEC致病方式主要通过产生黏附素和肠毒素，黏附素也叫定植因子，是一种菌毛蛋白，主要功能是介导细菌对宿主细胞的黏附。黏附素可以帮助ETEC避免肠道清除作用，进而可以在固定部位产生肠毒素，发挥致病作用。菌毛是ETEC引起腹泻的关键[2]。肠毒素主要分为热稳定肠毒素和热不稳定肠毒素，在胞外发挥作用[3-5]。临床治疗大肠杆菌病的药物主要是抗生素，但是由于细菌耐药和抗生素残留等问题，临床逐渐限用抗生素，因此选择替代抗生素的药物成为关键[6]。

槲皮素化学式为C15H10O7，是一种黄酮亲脂性植物化学物质，也是自然界多酚类化合物之一，存在于大量常见的中药和蔬菜水果中。近年来，大量研究发现槲皮素具有降低血压、抗氧化、抗肿瘤、抗炎和抗菌等作用[7-10]。

RNA-seq是转录测序的一种，通过高通量测序对mRNA、sRNA、非编码RNA或其中的一部分进行测序，以反映其表达水平，具有通量高、重复性好、检测范围广等优点，在医学、生态学和遗传学等研究领域广泛使用[11-13]。因此，本研究拟借助RNA-seq技术分析槲皮素对大肠杆菌的作用，为寻找抗生素替代药物提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂菌株：大肠杆菌O139(CVCC-1496)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

仪器：空气浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发公司)；电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；Q6000+紫外可见核酸蛋白测量仪(北京Quawell公司)；BioTek多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；CO2恒温细胞培养箱(赛默飞世尔科技有限公司)；立式自动电热压力蒸汽灭菌器(日本YAMATO公司)；实时荧光定量 PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

试剂：槲皮素(成都曼斯特生物科技有限公司)；二甲基亚砜(美国Sigma公司)；LB (Luria-Bertani)琼脂及LB肉汤(青岛海博生物技术有限公司)；Trizol(大连宝生物工程有限公司)；无水乙醇(成都市科龙化工试剂厂)；氯仿及异丙醇(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；miRNeasy Mini kit(QIAGEN)；反转录试剂盒及2×M5 Hiper Realtime PCR Super mix with Low Rox(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.2 菌种活化及培养将保存在-80℃的ETEC-O139取100 μL接种于30 mL LB培养基中，在37℃，180 r/min的摇床活化5 h，然后将活化的菌划线于LB琼脂培养基后，置37℃恒温培养箱12 h。

1.3 最小抑菌浓度(MIC)测定调整菌液浓度为1×108CFU/mL，用倍比稀释法配置不同药物质量浓度，第1管取4 mL菌液并加入槲皮素，使其最终质量浓度为20 mg/L，其余4管分别加入2 mL菌液，从第1管吸出2 mL液体加入第2管，依次倍比稀释，最后1管不做任何处理。将配好的液体接种于24孔板，每孔0.5 mL，放置37℃恒温培养箱培养6 h，酶标仪测600 nm处的D值。

1.4 ETEC-O139生长曲线测定取D600 nm=1.0的菌液以1∶500比例接种于50 mL LB肉汤培养基中，37℃，180 r/min摇床培养，用Q6000每2 h测定一次D600 nm值，共20 h。

1.5 RNA-seqETEC-O139在LB培养基37℃、180 r/min过夜培养，调整细菌浓度为1×108CFU/mL，设置3个组，ETEC-O139组、10 mg/L槲皮素组和20 mg/L槲皮素组，37℃恒温培养4 h。使用miRNeasy Mini kit提取RNA，然后进行总RNA样本检测。检测合格后，去除rRNA，之后合成双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库。文库构建完成，进行库检。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq/MiSeq测序。

1.6 qRT-PCR验证RNA-seq的差异表达基因

1.6.1细菌总RNA的提取及检测 调整细菌浓度为1×108CFU/mL，设置3个组，ETEC-O139组、10 mg/L槲皮素组和20 mg/L槲皮素组，37℃恒温培养4 h。取菌液使用TRIzol法进行RNA提取。使用微量核酸蛋白测定仪测定菌体RNA的浓度和纯度，随后进行反转录反应。

1.6.2反转录体系 根据测定的RNA浓度结果，将提取的RNA量调整一致。根据M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover 反转录试剂盒说明书，将RNA反转录为cDNA。

1.6.3实时荧光定量PCR 以rrsG为内参基因，选取与ETEC-O139生物膜及群体感应相关基因作为目标扩增基因，根据 NCBI 上已经公开发表的大肠杆菌基因的序列，利用 Primer 5.0 软件，分别设计上游引物和下游引物。引物交由上海生工生物技术有限公司合成。各基因的引物信息如表1所示。Real-time PCR反应体系：2×M5 Hiper Realtime PCR Super mix with Low Rox 10 μL；PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL；PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.5 μL；cDNA 2 μL；RNase free H2O 7 μL；总体积20 μL。循环参数：95℃预变性10 min;95℃变性15 s， 60℃退火和延伸1 min,40个循环。结果分析：建立各基因的扩增标准曲线，通过斜率、决定系数和扩增效率值3个参数共同评估各引物。试验结果采用2-△△Ct法评估目的基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1 最小抑菌浓度由图1可知，经过槲皮素处理的ETEC-O139组与未处理的ETEC-O139组相比，在600 nm处的D值并没有显著差异。因此，可以确定槲皮素在2.5～20 mg/L药物质量浓度不会抑制ETEC-O139的生长。后续试验选择槲皮素质量浓度为10，20 mg/L。

图1 最小抑菌浓度测定

2.2 ETEC-O139生长曲线结果由图2可知，与ETEC-O139组比较，经过药物处理的ETEC-O139组的细菌在不同的时间点上的D600 nm值并没有显著变化；表明药物处理后并未影响细菌生长。根据生长曲线和MIC确定后续试验槲皮素与细菌的作用时间为4 h。

图2 槲皮素对ETEC-O139生长曲线的影响

2.3 RNA-seq结果

2.3.1测序质量评估 对测序结果进行图像识别，去污染、去接头后得到Clean reads数量以及GC含量百分比等。各组A、T、C、G含量分布接近，并未出现分离情况。各组Q值均高于30，根据错误率计算公式Q=-10lg(error rate)，说明各组碱基错误率低于0.1%。另外，各组GC含量分布属于正态分布。综合以上结果，说明各组测序数据可靠，可以进行后续分析。

2.3.2差异基因表达 根据设定的阈值，在生成的MA plot和volcano plot两种图，均反映差异基因整体分布情况，槲皮素与ETEC-O139相互作用后，ETEC-O139整体的一些基因发生了变化。其中共有24个差异表达基因，19个基因上调，5个基因下调。

2.3.3差异基因GO富集分析 基因本体数据库(Gene Ontology，GO)包括基因的生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)三个方面。如图3A所示，与ETEC-O139组相比，用10 mg/L 的槲皮素处理后，槲皮素在细胞及细胞区域、细胞膜及膜区域和巨型分子复合物等部位发挥结合和催化活性的分子功能，引起ETEC-O139的细胞过程、代谢过程、对刺激反应、生物调节、生物过程调节、定植、移动和单细胞过程和多细胞过程等细胞表型发生变化。如图3B所示，与ETEC-O139组相比，用20 mg/L的槲皮素处理后，槲皮素在细胞及细胞区域、细胞膜及膜区域和巨型分子复合物等部位发挥结合、催化活性和核酸转录因子活性等分子功能，引起ETEC-O139的细胞过程、代谢过程、对刺激反应、生物调节、生物过程调节、定植和单细胞过程和多细胞过程等细胞表型发生变化。结果表明，槲皮素对ETEC-O139发挥一定分子功能，会导致ETEC-O139的表型发生变化。

A.ETEC-O139组与 10 mg/L槲皮素组;B.ETEC-O139组与 20 mg/L槲皮素组图3 差异基因GO分类柱状图

2.3.4KEGG富集分析 如图4所示，差异表达基因发生变化的Pathway Hierarchy1分别是细胞过程(cellular processes，CP)、环境信息处理(environmental information processing，EIP)和代谢(metabolism，M)。另外，如图4A所示，ETEC-O139用10 mg/L槲皮素处理后，差异表达基因发生变化的Pathway Hierarchy2分别为信号转导、细胞运动、膜转运、其他氨基酸代谢、辅酶因子和维生素代谢以及核酸代谢。如图4B所示，ETEC-O139用20 mg/L槲皮素处理后，差异表达基因发生变化的Pathway Hierarchy2分别为原核细胞细胞群落、信号转导、膜转运、其他氨基酸代谢、辅酶因子和维生素代谢、核酸代谢和多糖合成和代谢。根据富集最显著的通路(KEGG pathway，即Pathway Hierarchy3)绘制出差异表达基因KEGG富集散点图。经过10 mg/L槲皮素处理后，差异表达基因发生变化的KEGG pathway分别为嘧啶代谢、ABC转运子、泛酸和辅酶A的合成、β-丙氨酸代谢、细菌趋化和双补体系统。经过20 mg/L槲皮素处理后，差异表达基因发生变化的KEGG pathway分别为ABC转运子、生物膜生成、脂多糖合成、群体感应、嘧啶代谢、双补体系统、泛酸和辅酶A的合成、β-丙氨酸代谢。一些重要的基因在通路中的变化如表2所示。

A.ETEC-O139组与10 mg/L槲皮素组;B.ETEC-O139组与20 mg/L槲皮素组。图4 差异基因KEGG分类图

表2 差异表达基因相关通路变化

2.4 qRT-PCR验证相关基因表达的变化为了验证RNA-seq的准确性，选择qRT-PCR对相关基因进行验证。结果如图5所示，与ETEC-O139组相比，经过槲皮素处理的ETEC-O139的lsrR、mglA、mglB、kdsD、waaA、waaF和gmhA基因的表达水平显著下降。

图5 槲皮素对ETEC-O139相关基因表达的影响

3 讨论

临床治疗大肠杆菌病的药物主要是抗生素，但是抗生素带来的食品安全问题和耐药问题，迫使人们不得不更换新的治疗途径。靶向细菌毒力因子成为一种新的抗菌疗法，不直接杀菌因而不会对细菌造成生长压力，降低细菌耐药性发生率[14]。近年来槲皮素成为研究热点，槲皮素具有多种生物学功能，例如抗增殖和抗凋亡作用，抑制癌细胞的生长，如肺癌、乳腺癌、食道癌和结肠癌等[15-16]。许多研究表明，槲皮素可以作为群体感应抑制剂[8,17-19]，同时还有资料表明槲皮素具有抑制细菌生物膜生成的作用[20]。

药物在2.5～20 mg/L质量浓度时对细菌生长不会产生抑制作用，因此选择10,20 mg/L两个药物质量浓度与ETEC-O139相互作用进行RNA-seq试验。根据RNA-seq综合数据评估分析可知数据准确。将差异基因进行Gene Ontology分析发现ETEC-O139经过槲皮素处理过后，相应的生物过程发生变化，生物过程决定生物表型，说明相应的表型也发生了变化。为了验证表型变化是如何实现的，将差异表达基因进行KEGG通路分析。差异表达基因发生变化的通路主要有脂多糖合成、群体感应、生物膜生成、细菌趋化、双补体系统、ABC转运蛋白、泛酸和CoA合成、β-丙氨酸代谢和嘧啶代谢。脂多糖即内毒素，构成大部分革兰阴性菌外膜，主要由3部分组成：脂质A、核心多糖和O抗原[21]。群体感应系统是一种细菌细胞间的交流，这种交流的基础是一种自诱导分子 (autoinducer，AI)。群体感应主要通过AI调节相关基因表达，因此可以影响细菌群体密度变化[22-23]。细菌趋化即细菌感受环境中的化学梯度，向更有利的环境条件移动的过程。动态微生物如大肠杆菌可以通过甲基接受趋化蛋白的跨膜受体来检测和跟踪环境中的化学梯度变化，大肠杆菌模型也是研究最多的趋化模型[24]。双补体系统主要在调节细菌生长和运动、生物膜生成、毒力因子产生以及在细菌耐药等方面发挥作用，因为细菌必须不断感知环境变化，才能生存和繁殖[25]。细菌趋化是双补体系统的相关通路，但是，我们在RNA-seq分析中发现两者并非通过相关上下游方式发生变化，而是单独发生变化。ABC (ATP-binding cassette) 转运蛋白是一种完整的膜内蛋白，是已知最大的蛋白家族之一，可以利用ATP水解为ADP产生能量逆浓度梯度转运分子通过脂质膜[26]，由两个跨膜结构域和两个核苷酸结构域组成。β-丙氨酸代谢是嘧啶代谢、泛酸和CoA合成的相关通路，嘧啶代谢是β-丙氨酸代谢通路的上游，泛酸和CoA的合成是β-丙氨酸代谢通路的下游，RNA-seq分析发现三者通过相同基因建立相关通路，说明药物引起三者发生变化是通过相关上下游通路作用的。KEGG整体反映药物与细菌相互作用后主要是在膜转运、催化反应、细菌运动和代谢发生变化，GO分析和KEGG分析结果相互印证。

为了验证RNA-seq分析，我们选择了调节毒力因子以及致病相关的通路中的差异表达基因进行验证。在大肠杆菌群体感应系统中，lsrR是群体感应转运过程中lsr的抑制子，可以阻碍lsr转运自诱导分子AI-2进而发挥抑制群体感应的作用[27]。RNA-seq分析显示lsrR属于上调基因，通过qRT-PCR验证发现药物抑制lsrR的表达，但是随着药物浓度增加lsrR的表达呈现出上升趋势。mglB在参与细菌运动过程发挥重要作用，细菌在环境中需要通过调节运动优化自己与环境之间的作用[28]。 RNA-seq分析结果表明，mglB属于上调表达基因，经过qRT-PCR验证发现药物抑制mglB的表达，但随着药物质量浓度增加，mglB的表达量也逐渐增加。另外，mglA的表达趋势和mglB的表达趋势也是一致的。针对这两个通路，并没有对通路中其他基因进行验证。但是RNA-seq分析中发现槲皮素抑制脂多糖合成过程中的kdsD的表达，kdsD是阿拉伯糖-5-磷酸异构酶，在脂多糖合成过程中发挥重要作用[29]，qRT-PCR验证结果与RNA-seq结果一致，而且随着药物浓度增加呈现出表达递减趋势。根据这一结果，对脂多糖合成过程中的其他基因也进行了qRT-PCR验证，结果表明槲皮素也抑制waaA、waaF和gmhA基因的表达，这3个基因在脂多糖合成过程中发挥重要作用，因此可以说明槲皮素可通过抑制脂多糖的合成达到降低产肠毒素大肠杆菌致病性的作用。

综上所述，本研究为槲皮素可以替代抗生素治疗产肠毒素大肠杆菌的药物提供理论依据，槲皮素不直接杀菌，而是通过抗毒力方式作用于产肠毒素大肠杆菌。根据本研究结果发现槲皮素调节毒力因子可能不止通过一个靶点，其他靶点有待于后续研究。