丹参多糖缓解小鼠乳腺炎症和过氧化反应的作用与机制

靳国忠，窦萌萌，张 迪，刘 维，吴占军，史万玉，2*，包永占* (.河北农业大学 中兽医学院，河北 保定 07000；2.河北省兽用中药制剂技术创新中心，河北 辛集 52690；.河北省农林科学院 粮油作物研究所，河北 石家庄 05005)

奶牛乳腺炎是困扰奶牛养殖业的主要疾病之一[1]。常规的抗生素治疗，存在耐药性和药残问题[2-3]，极易影响乳品质量，导致经济损失。当下国家稳步推行的畜禽养殖端“减抗限抗”行动，使中药及其提取物的使用成为了研究的新热点[4]。作为丹参的有效成分，丹参多糖一定程度上保留了丹参的抗炎抗感染作用[5]，本实验室前期试验表明丹参多糖能够降低炎性因子水平[6]，拮抗肝脏脂质过氧化反应[7]，缓解小鼠免疫性肝损伤。丹参多糖在乳腺组织的抗炎抗氧化作用尚未明确，本试验旨在以丹参多糖为研究对象，研究其对小鼠乳腺炎症损伤的保护作用，并探讨其作用机制，为丹参多糖在奶牛养殖上的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料丹参多糖(杭州正大青春宝药业有限公司)；脂多糖(LPS)干粉试剂，总一氧化氮合成酶(T-NOS)，还原型谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)购自Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；IKK抗体，IκB-α和P65抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；TNF-α；IL-6和IL-1β ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，实时荧光定量PCR引物(表1)，免疫荧光试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；8周龄，35 g左右的实验用昆明小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)2019-0011。

表1 实时荧光定量PCR引物及相关信息

1.2 动物分组与处理将120只成年昆明小鼠(30只雄鼠、90只雌鼠)按照雌雄比例3∶1合笼饲养。检查确认雌鼠受孕后与雄鼠分离单笼饲养静待分娩。选取60只分娩母鼠随机分成A(空白对照组)、B(模型组)、C(250 mg/kg丹参多糖低剂量组)、D(500 mg/kg丹参多糖中剂量组)以及E(750 mg/kg丹参多糖高剂量组)5组，每组12只。母鼠分娩后，按分组剂量对其进行连续1周的灌胃(0.2 mL/只)，模型组和对照组灌服等体积生理盐水。灌胃1周后进行乳腺炎的造模：用10%水合氯醛麻醉母鼠，以酒精棉球对第4对乳头进行消毒，轻轻剪去乳头前端暴露乳腺导管，使用磨钝的30 g针头通过乳导管缓慢注入LPS溶液(2 g/L)，每侧50 μL。造模完成后，将母鼠与仔鼠分离饲养24 h，眼球采血后处死，分离血清，剥离乳腺组织备用。将一部分乳腺组织固定于4%甲醛溶液，另一部分于-80℃保存。

1.3 指标的检测

1.3.1小鼠临床表现及乳腺剖检变化观察 造模后，观察各组母鼠精神状态差异，外观变化，24 h后脱颈处死母鼠，小心剪开腹部皮肤，充分暴露两侧乳腺组织。观察不同组别之间乳腺组织的变化。

1.3.2乳腺组织病理学观察 严格按照石蜡切片的制作流程对固定好的乳腺组织进行石蜡切片制作。对制作好的切片进行H&E染色，中性树脂封片。显微镜下观察各组乳腺组织的病理学变化。

1.3.3血清中炎性因子水平测定 对各组小鼠应用眼球采血法采血并分离血清，按照ELISA试剂盒说明书测定TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

1.3.4乳腺组织中过氧化指标含量测定 从-80℃冰箱中取出乳腺组织，按照各氧化指标试剂盒说明书操作，制成组织匀浆。进行T-NOS、 GSH、 MDA、 SOD和CAT指标检测。

1.3.5乳腺组织中IκB-α、IKK和NF-κB蛋白的表达水平测定 使用防脱载玻片制作石蜡切片，对制作好的石蜡切片进行免疫组化染色，特异性抗体孵育完成后进行常规封片。晾干后高倍显微镜下观察，蛋白的阳性反应呈棕黄色圆点状聚集。随机拍下视野后，使用ImageJ软件计算各组阳性表达的光密度值，进行半定量分析。

1.3.6乳腺组织中IκB-α、IKK和NF-κB mRNA表达水平测定 从-80℃超低温冰箱中取出小鼠乳腺组织，按照总RNA提取试剂盒操作说明，在无菌无酶的条件下使用经高压的器械严格操作，提取mRNA，测定和调整浓度后进行反转录反应。使用反转录获得的cDNA，按照实时荧光定量PCR说明书进行各指标的mRNA水平检测。

1.4 数据统计及分析使用 Excel软件和GraphPadPrism 7.0软件对数据进行分析。组间多样本使用单因素方差分析(ANOVA)，同时进行组间比较，P<0.05 表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 丹参多糖对各组小鼠临床表现及乳腺病理变化的影响空白对照组小鼠精神状态活跃，食欲正常，体表被毛柔顺有光泽，剖检可见乳腺中乳汁充盈；模型组小鼠精神萎靡，基本不食，畏寒扎堆，体表被毛杂乱，剖检见乳腺红肿、有出血点。丹参多糖用药组小鼠精神略萎靡，食欲好于模型组小鼠，剖检可见乳腺红肿减轻和出血面积减小。

2.2 丹参多糖对各组小鼠乳腺剖检变化的影响如图1所示，空白对照组乳腺组织可观察到完整的细胞形态和结构，乳腺细胞细胞核清晰可见，所构成的腺泡也完整清晰，无炎性细胞和巨噬细胞浸润，无病理特征；模型组乳腺组织中可以观察到有大量的炎性细胞浸润，部分区域腺泡壁崩解，腺泡完整性被破坏；各丹参多糖用药组炎性细胞和巨噬细胞的浸润与模型组相比显著减少，其中丹参多糖高剂量组基本无炎性细胞浸润，腺泡整体结构趋向于空白对照组乳腺组织的状态。

A.空白对照组；B.模型组；C.丹参多糖低剂量组；D.丹参多糖中剂量组；E.丹参多糖高剂量组。图中箭头所指代表小鼠乳腺组织中炎性细胞浸润和腺泡壁结构被破坏图1 丹参多糖对乳腺炎小鼠乳腺组织病理学变化的影响(×400)

2.3 丹参多糖对小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平的影响如图2所示，与空白对照组相比，模型组和各用药组的IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组相比，除IL-1β的表达水平与低剂量组与模型组无显著性差异外，各用药组炎性因子水平都显著降低(P<0.05或P<0.01)，且具有剂量依赖性。

A.丹参多糖对血清TNF-α表达水平的影响；B.丹参多糖对血清IL-6表达水平的影响；C.丹参多糖对IL-1β表达水平的影响。与空白对照组相比，*代表P<0.05，**代表P<0.01；与模型组相比，#代表 P<0.05，##代表P<0.01。下同图2 丹参多糖对小鼠乳腺组织中炎性因子表达水平的影响

2.4 丹参多糖对小鼠乳腺组织中过氧化指标的影响如图3所示，模型组T-NOS酶活力水平较空白对照组显著上升(P<0.05)，用药组与空白对照组无显著性差异，用药组与模型组相比，除低剂量组外，中、高剂量组均显著降低(P<0.05)；模型组MDA含量显著高于空白对照组(P<0.01)，低剂量组与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，中高剂量组与空白对照组相比无显著性差异，用药组与模型组相比，MDA含量均显著性降低(P<0.05或P<0.01)；模型组SOD含量与空白对照组相比显著降低(P<0.01)，用药组与模型组相比均显著性升高(P<0.01)，低剂量组与空白对照组具有显著性差异(P<0.05)；GSH水平上，与空白对照组相比，模型组存在极显著性差异(P<0.01)，低、中剂量组存在显著性差异(P<0.05)，与模型组相比，低、中剂量组无显著性差异，高剂量组显著升高(P<0.01)；模型组和用药组CAT与空白对照组相比均显著降低(P<0.05或P<0.01)，与模型组相比，中、高剂量组显著升高(P<0.01)，低剂量组无显著性差异。

图3 丹参多糖对小鼠乳腺组织中过氧化指标表达水平的影响

2.5 丹参多糖对小鼠乳腺组织中IκB-α、IKK和NF-κB表达水平的影响

2.5.1丹参多糖对各组小鼠乳腺组织IκB-α表达水平的影响 如图4A所示，与空白对照组相比，模型组小鼠乳腺组织中IκB-α的表达水平显著升高(P<0.01)；丹参多糖各用药组与模型组相比显著降低(P<0.01)；低剂量丹参多糖组与空白对照组间存在显著性差异(P<0.01)，中、高剂量丹参多糖组与空白对照及模型组之间无显著性差异。

图4A 丹参多糖对各组小鼠乳腺组织中IκB-α表达水平的影响

2.5.2丹参多糖对各组小鼠乳腺组织IKK表达水平的影响 如图4B所示，模型组小鼠乳腺组织中IKK蛋白的表达水平显著高于空白对照组(P<0.01)；丹参多糖用药组与模型组相比，小鼠乳腺组织的IKK蛋白表达水平均有显著性降低(P<0.01)；丹参多糖各剂量组与空白对照组比较均存在显著性差异(P<0.01)。

图4B 丹参多糖对各组小鼠乳腺组织中IKK表达水平的影响

2.5.3丹参多糖对各组小鼠乳腺组织NF-κB表达水平的影响 如图4C所示，与空白对照组相比，模型组NF-κB表达水平显著上升(P<0.01)；与模型组相比，丹参多糖各用药组NF-κB表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)；低、高剂量丹参多糖组与空白对照组之间均存在不同程度的显著性差异(P<0.05或P<0.01)，中剂量组与空白对照组无显著性差异。

图4C 丹参多糖对各组小鼠乳腺组织中NF-κB表达水平的影响

2.6 丹参多糖对小鼠乳腺组织中IκB-α、IKK和NF-κB mRNA表达水平的影响如图5所示，模型组小鼠乳腺组织中IκB-α、IKK和NF-κB mRNA的表达水平显著高于空白对照组(P<0.01)；各丹参多糖剂量组与模型组相比较，除低剂量组小鼠乳腺组织中NF-κB的mRNA水平与模型组无显著性差异外，其余3个用药组的各个指标与模型组之间均存在显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且降低趋势上呈现出剂量依赖性。

图5 丹参多糖对各组小鼠乳腺组织中IκB-α(A)、IKK(B)、NF-κB(C)mRNA表达的影响

3 讨论

中性粒细胞和巨噬细胞大量浸润是炎症发生时乳腺组织的病理特征。在LPS诱导的急性炎症中，中性粒细胞被募集到炎症发生的部位以进行机体的免疫应答[8]，有研究表明，巨噬细胞的自噬水平可以影响促炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平[9]。组织中巨噬细胞数量的多寡间接的反映了炎性因子的表达水平以及炎症的严重程度。本试验中，乳腺炎小鼠模型的构建主要参考了阚兴池[10]的试验方法，并作了符合本试验实际情况的改进。结果显示，模型组小鼠乳腺组织中炎性细胞浸润程度显著大于空白对照组，并且丹参多糖用药组小鼠乳腺组织炎性细胞浸润程度明显低于模型组。这既表明成功建立了乳腺炎症模型，又说明丹参多糖在日常饲料中的添加可以减缓乳腺炎症的损伤程度。

作为主要的促炎因子，IL-1β、IL-6和TNF-α的表达上调促进了机体炎症的发生。在发生炎症时如何减少这些促炎因子的表达，就成为了研究如何缓解炎症对机体损伤的关键点。相关研究通过减少IL-1β、IL-6和TNF-α的表达[11-13]，成功的缓解了细胞水平的炎症损伤。本试验结果表明，丹参多糖用药后降低了促炎因子的表达，抑制了炎症的发生和发展，而且这些促炎因子水平的下降和丹参多糖用药剂量呈正相关。

奶牛乳腺炎的致病因素主要是以革兰阴性菌为主的大肠杆菌及其在动物机体内增殖过程中产生的一些代谢产物，这些代谢产物中又以LPS最为经典[14]。LPS诱导炎症发生主要是通过激活TLR4信号通路[15]，有研究通过药物抑制了NF-κB信号通路从而截断了TLR4信号通路的传导，以此达到了缓解炎症的目的[16]。因此，有理由认为NF-κB信号通路直接影响了炎症的发生程度。使用药物调控这些因子可能是缓解炎症造成损伤的一种保健和治疗思路。阚兴池[10]通过药物抑制AKT/IKK/NF-κB信号通路减少了促炎症介质的产生，达到了减轻乳腺组织炎症的目的。本试验结果显示，模型组IKK、IκB和NF-κB的表达水平显著上升，这与MUHAMMAD等[17]研究中IκB等蛋白发生的过表达变化相一致。丹参多糖用药组IKK、IκB和NF-κB的表达水平较模型组均有显著下降；在mRNA水平上，模型组与空白对照组比，用药组与模型组比，IKK、IκB和NF-κB的变化趋势与蛋白表达水平变化趋势基本相同。表明丹参多糖可以有效地抑制IKK、IκB和NF-κB在小鼠乳腺组织中的表达水平。丹参多糖可以在一定程度上通过抑制NF-κB信号通路的激活缓解炎症对乳腺组织的损伤。

NF-κB信号通路的激活是乳腺炎症发生的机制之一，而直接造成乳腺组织损伤的是组织本身发生的氧化应激。机体通过动态的调控自由基的产生和清除，维持自身的健康状态。当发生炎症或有其他因介入时，自由基的动态平衡难以维持，氧化应激就会产生[18]。一氧化氮(NO)作为一种小气体分子，在机体组织中属于不稳定的信号介质。NO在机体中的活动，会促进炎症向更高程度转归，使用药物抑制NO的产生，可以缓解细胞受到的氧化应激。由于NO的不稳定，在测定上存在一定的难度，可通过检测诱导NO产生的T-NOS的活力，间接测定NO在机体组织中的变化。MDA和SOD经常配合使用来测定机体的抗氧化能力和氧化损伤程度。通过药物上调SOD清除机体氧自由基的能力，增强组织的抗氧化能力，可以维持组织在炎症和氧化应激中的健康状态。利用药物减少MDA在机体中的累积，可以缓解氧自由基对机体的攻击损伤。苏芮[19]的研究在一定程度上揭示了硒的添加可以提升SOD活力，降低MDA含量，最终达到了减缓奶牛乳腺细胞的氧化应激的目的。GSH作为一种三肽，是GSH-PX和GSH-ST 2种酶的重要底物，可以帮助酶分解氢过氧化物。作为重要的非酶类抗氧化物，GSH的含量反映了机体的抗氧化能力。于冬冬等[20]从GSH和GSH-PX的角度，通过针灸的方法有效的提升了肝损伤模型小鼠体内GSH的水平，改善了小鼠肝细胞的炎症，增强了小鼠肝细胞的抗氧化能力。CAT是一种关键的抗氧化酶，可以有效地清除组织中的氢过氧化物。张雅等[21]研究发现，培养液中维生素E的添加可以提升H2O2处理的奶牛乳腺细胞中CAT的活性，这与本试验中口服丹参多糖后的造模组小鼠的乳腺组织中过氧化氢酶活性的变化结果相一致。

综上，丹参多糖能够抑制NF-κB信号通路相关因子的激活，增强乳腺组织的抗氧化能力，最终减轻乳腺组织炎症的损伤程度。该结果为应用丹参多糖防治奶牛乳房炎提供了理论依据。