枯草芽孢杆菌通过抑制NF-κB通路改善LPS诱导的小鼠乳腺炎

邱 敏，冯炼君，赵才军，包丽娟，李 爽，郝浩扬，付云贺，胡晓宇，张乃生 (吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

乳腺炎是奶牛尤其高产奶牛最为严重的疾病之一，会对乳腺组织造成损伤，降低产奶量和乳质量，增加死亡率和扑杀率[1]。通常认为乳腺炎症主要由细菌感染所致，大肠杆菌是最主要的病原体之一[2-3]。当大肠杆菌感染宿主细胞，其细胞壁的脂多糖被Toll样受体4(TLR4)识别，进而引发免疫反应[4]，导致核因子κB(NF-κB)信号通路的激活，并诱导促炎因子的表达[5]。目前常用的乳腺炎治疗方法是抗生素以及激素疗法，但长期的抗生素治疗会造成大量耐药细菌的产生，同时抗生素残留也会对人类健康造成巨大的威胁，这对畜牧业健康发展带来了严重危害[6]。因此，寻找一种安全高效可代替抗生素的药物迫在眉睫。枯草芽胞杆菌(B.subtilis)广泛存在水体、土壤及动物的胃肠道中，某些菌株在宿主体内表现出抗菌、抗氧化和免疫调节活性[7]。而且，B.subtilis易于分离和培养，已成为抗生素的最佳替代品之一[8]。因此，本研究旨在从奶牛乳汁中筛选出优势B.subtilis，并将此优势菌株应用于动物试验，探讨其抗炎作用，为乳腺炎的预防提供了新的可能性，也为B.subtilis制剂的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄BALB/c小鼠30只，雌性20只，雄性10只，购自辽宁长生生物科技有限公司。动物试验经吉林大学动物伦理委员会批准。适应环境1周后，雌性和雄性在小型隔离笼子中以2∶1的比例混合。试验期间给予充足的食物和饮水。

1.2 主要试剂TNF-α，IL-1β ELISA检测试剂盒购自BioLegend公司；LPS(Escherichiacoli055：B5)购自美国Sigma公司；蛋白检测试剂盒购自Thermo公司；β-actin、p65、IκB、p-p65、p-IκB、ZO-1和Claudin 3 单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；MPO试剂盒购自南京建成有限公司。

1.3 细菌及培养条件从吉林省白城地区奶牛场健康奶样品中分离到B.subtilis。B.subtilis在TSB培养基中37℃、120 r/min条件下培养过夜，D600 nm约为0.5(约1×108CFU/mL)。

1.4 乳腺模型建立及分组将产后5～7 d的20只雌性BALB/c小鼠随机分为4组：对照组、LPS组、B.subtilis组(每100 μL PBS含1×108CFU)、B.subtilis(每100 μL PBS含1×108CFU)+ LPS组。为了诱导乳腺炎，将LPS(1 g/L)注射到小鼠的每侧乳腺中。在LPS处理前2 h，将B.subtilis分别注射到两侧乳头。对照组小鼠相同部位注射等体积无菌PBS。LPS处理后24 h对小鼠进行剖杀并取其乳腺组织，储存在-80℃下。

1.5 HE染色将各组乳腺组织样品在4%多聚甲醛中固定48 h。将样品嵌入石蜡中，并切成4 μm的切片。脱脂后，用苏木精和伊红染色，在光学显微镜下进行组织学评估。

1.6 乳腺组织MPO活性检测取乳腺组织，在冰上用反应缓冲液将其制备成匀浆。MPO活性的检测方法按照试剂盒说明书进行操作。通过在460 nm 处测量吸光度来检测酶的活性。

1.7 ELISA检测利用ELISA试剂盒检测炎性细胞因子，具体操作参照制造商说明书进行。在冰上将乳腺组织移入匀浆器，加入预冷的PBS(质量/体积比为1∶9)，将组织制备成匀浆。将匀浆4℃,12 000 r/min 离心10 min，去除脂质层，收集中间上清液进行检测。使用酶标仪检测样品在450 nm和570 nm处的吸光值。

1.8 Western blot使用组织蛋白提取试剂盒提取乳腺组织的总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，制备样品。配制分离胶和浓缩胶，进行SDS-PAGE，然后将蛋白样品转移到PVDF膜上，并在室温下用5%的脱脂牛奶封闭2 h。清洗后依次孵育一抗以及二抗，最后加入ECL试剂显影后观察结果。

1.9 免疫组织化学所有乳腺组织在常规中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，将载有石蜡包埋组织的载玻片在二甲苯和不同浓度的酒精中进行脱蜡；用0.01 mmol/L枸楷酸盐缓冲液热修复；自然冷却后置于3%过氧化氢中，37℃ 10 min,PBS冲洗3 min×3次；将切片与Claudin-3(1∶700)抗体，ZO-1(1∶700)抗体在4℃进行孵育过夜；洗涤3次后，将切片与HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000)在37℃下孵育20 min；DAB染色后，显微镜下观察。

2 结果

2.1B.subtilis对LPS诱导的乳腺组织病理学的影响如图1所示，对照组和单独B.subtilis处理组小鼠乳腺组织形态正常，无组织病理学变化，LPS组小鼠的乳腺组织出现水肿、明显的中性粒细胞浸润，显示B.subtilis处理明显减弱了LPS诱发的乳腺病理损伤以及炎性细胞的浸润。此外，炎症评分也显示，B.subtilis减弱了LPS诱导的乳腺组织损伤。

A.对照组；B.BS组；C.LPS模型组；D.BS+LPS组；E.组织病理学评分。组织病理学指标是通过充血(0～3级，从正常到严重，包括正常、轻度、中度、重度)和中性粒细胞浸润程度(0～5级)进行评价。图中BS代表B.subtilis,下同图1 乳腺组织病理学变化

2.2B.subtilis对LPS诱导的乳腺组织中促炎症细胞因子产生的影响从图2可知，与对照组相比，LPS组的TNF-α和IL-1β表达量显著增加(P<0.05)；与LPS组相比，用B.subtilis预处理后，TNF-α和IL-1β的含量显著减少(P<0.05)。

A.TNF-α；B.IL-1β。试验重复3次，图中展示了代表性结果图2 乳腺组织炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的变化

2.3B.subtilis对LPS诱导的乳腺组织中MPO活性的影响MPO活性可直接反映中性粒细胞的数量。如图3所示，LPS组小鼠乳腺组织中MPO活性极显著高于对照组(P<0.001)；与LPS组相比，用B.subtilis预处理后，小鼠乳腺组织中MPO活性极显著下降(P<0.001)。

图3 乳腺组织中MPO活性的变化

2.4B.subtilis对NF-κB信号通路的影响为了阐明B.subtilis的抗炎机制，我们研究了B.subtilis对NF-κB信号通路的影响。如图4所示，与对照组相比，LPS处理组小鼠乳腺组织中IκB的磷酸化水平和NF-κB p65的磷酸化上调；同LPS处理组相比，B.subtilis预处理组小鼠乳腺组织中IκB和NF-κB p65的磷酸化水平明显减少。同时，与对照组相比，B.subtilis处理组在这些信号通路上没有明显的变化。

A.NF-κB信号通路蛋白的Western blot结果；B.p-p65的相对表达水平；C.p-IκB的相对表达水平。试验重复了3次，图中展示了代表性结果图4 BS对LPS诱导的乳腺炎NF-κB信号通路的影响

2.5B.subtilis对乳腺组织中紧密连接蛋白表达的影响为了研究B.subtilis对LPS诱导的乳腺上皮屏障完整性的影响，检测了ZO-1和Claudin-3的表达水平。如图5所示，同对照组相比，LPS处理组小鼠乳腺组织中的ZO-1和Claudin-3的含量明显减少；同LPS处理组相比，B.subtilis预处理组小鼠乳腺组织中ZO-1和Claudin 3的含量明显提高。

A.Claudin-3表达的变化(a.对照组； b.BS组；c.LPS模型组；d.BS+LPS组)；B.ZO-1表达的变化(a.对照组； b.BS组；c.LPS模型组；d.BS+LPS组)。阳性染色为褐色；每个样品至少随机拍摄5～8张不同部位的图片，图中展示了各组代表性结果图5 乳腺组织细胞连接处紧密连接蛋白Claudin-3和ZO-1分布的变化(×200)

3 讨论

乳腺炎一般由机械、物理、化学、病原微生物等引起[9]，其中病原菌感染是乳腺炎的主要原因，大肠杆菌是主要致病菌之一，脂多糖作为其细胞壁主要活性成分在致病过程中发挥着重要作用[10]。最近，越来越多的研究表明，益生菌有可能治疗多种疾病，如炎症性肠病、肥胖症和糖尿病[11-12]。B.subtilis是一种无毒、无残留、无抗药性的益生菌[13]，广泛存在水体、土壤及动物的胃肠道中，具有抑制细菌生长、调节肠道菌群及提高动物免疫力的作用，B.subtilis易于分离和培养，已成为抗生素的最佳替代品之一[14]。有报道说，B.subtilis对普通抗生素没有抵抗力，可以作为益生菌的候选者[12]。因此，本研究使用小鼠乳腺炎模型来研究B.subtilis对乳腺局部炎症的保护作用。

细胞因子是炎症反应的指标，包括促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子[15]。LPS可通过激活乳腺上皮细胞中的NF-κB激活TLR4并启动先天免疫和炎症反应，从而诱导促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达[16]。本研究结果显示，B.subtilis明显减少了TNF-α和IL-1β的产生，表明B.subtilis改善了LPS引起的炎症程度。MPO是中性粒细胞的功能标志和活化标志，其水平和活性的变化代表了中性粒细胞(PMN)的功能和活性状态[16]。本研究表明，LPS组的MPO活性明显高于对照组，B.subtilis预处理组MPO活性明显下降。NF-κB信号通路已被证明与各种炎症反应中炎症介质基因的转录和调控有关[17]。本研究结果显示，B.subtilis通过抑制NF-κB信号通路的激活，减少了促炎症细胞因子的产生。研究发现，ZO-1和Claudin-3在维持和调节细胞上皮屏障功能、调节细胞物质运输、维持细胞极性和信号转导等方面起着重要作用[18]。免疫组化的结果显示，B.subtilis可以明显增加细胞连接处的紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-3的分布。综上所述，B.subtilis预处理可以有效抑制LPS引起的小鼠乳腺炎，本研究为B.subtilis的益生菌作用提供了支持，为治疗炎症性疾病提供了合理的参考，同时也证明B.subtilis可能是一种有治疗乳腺炎潜力的候选菌。