肝豆状核变性家系全基因组分析1例报告

胡亚欣， 程 卓， 丛 硕， 刘咏梅， 张宝芳， 雷 榆， 严 昭，张懿炜， 蒲 茜， 余 蕾， 程明亮

1 贵州医科大学附属医院a.产前诊断中心， b.输血科， c.检验科， d.感染科， 贵阳 550004；2 北京大学第三医院消化科， 北京 100191； 3 贵州医科大学研究生院, 贵阳 550004；4 贵阳市妇幼保健院， 贵阳 550004

肝豆状核变性又称Wilson病，是由于铜转运蛋白相关基因ATP7B的突变或缺失而导致铜在体内蓄积而引起的疾病，遗传模式为常染色体隐性遗传[1]。临床表现为肝脏损害、神经系统表现、肾脏损伤、出现角膜K-F环等，涉及机体多个系统和器官，以肝脏或神经系统的损伤为主要表现形式。ATP7B 基因定位于人类染色体13p14.3 上，具有21个外显子区域[2]。目前已发现的有害基因突变有800余种(人类基因突变数据库www.hgmd.org)。研究表明，不同的基因突变位点与不同的临床表现相关。

1 病例资料

先证者(图1，箭头所示)，男，40岁。于15岁时，出现口齿不清、流涎、步态不稳等症状，角膜K-F环阳性，被诊断为肝豆状核变性，规律服用青霉胺治疗后，症状逐渐得到控制；血清铜2.20 μmol/L，尿铜1130 μg/24 h。查问家族史，先证者有3个姐妹，其中2个在青少年时期死亡。姐姐在10余岁时，死于剧烈运动诱发的肝衰竭；一个妹妹也在童年时期出现高烧及恶性黄疸，经治无效死亡。由于当时的诊疗条件有限，未能明确诊断，但结合二者病史特点临床高度疑似肝豆状核变性。先证者另一位妹妹(图1，Ⅱ5)，在先证者确诊后，也进行了基因检测，结果与先证者ATP7B基因突变相同。先证者父亲尿铜112 μg/24 h，轻度升高，无其他临床表现；母亲尿铜31 μg/24 h，属于正常范围；妹妹139 μg/24 h，轻度升高，无相关临床症状。

图1 患者家族系谱图

经对该家系进行全基因组测序分析，发现先证者及其妹妹均有来自于父亲的c.2304dupC及来自于母亲的c.2975C>T两个突变。前者是一个罕见的突变，后者在东亚为一个热点突变[3]。已有报道[4]，先证者与一健康女子结合，婚后反复4次自然流产。健在的妹妹33岁，无肝豆状核变性的任何症状，检查发现尿铜轻度升高，同其父相似。为了探究先证者及其妹妹具有相同基因型，但表型不同的原因，笔者对该家系进行了全基因组基因测序、GO及KEGG分析，以明确兄妹二人的基因组差异。

1.1 高通量测序 提取样品后，通过严格的质检，将合格后的样品DNA片段随机打断，构建文库，添加adaptor，PCR扩增，然后利用illumina机器进行测序。去除低质量序列，得到最终的clean reads，分析SNP、Indel、CNV、SV 变异，并用软件对结果进行注释。涉及到的软件包括BWA(Burrows-Wheeler Aligner)0.7.5a-r405、Samtools( Sequence Alignment/Map Tools) 0.1.19、Picard-Tools 1.57、Genome Analysis Toolkit 2.5-2-gf57256b、pindel-v0.2.2、SnpEff、Annovar、KOBAS 2.0、topGO、CREST、CNVnator等。测序深度达到10X的覆盖比例均在99%以上，达到20X的覆盖比例为93.57%以上。在数据库中比对匹配比例92.72%以上。

1.2 罕见基因突变分析 筛选过滤已知数据库(千人数据库、400Kberry、ESP6500)，过滤掉高频位点(频率>5%)的突变，并对铜离子吸收代谢过程中的直接或间接相关基因ATP7A、ATP7B、ADNP、APOA4、ATOX1、CCS、COX17、COX11、PAM、PRND、SNCA、SOD1等进行逐个分析比对。在家系中共发现了15 865个罕见基因位点突变，3667个indel短序列插入或缺失片段，4148个CNV变异，以及1044个SV变异。对铜离子代谢相关基因突变进行逐个分析，发现先证者的ATP7A、ATP7B、ADNP、APOA4、ATOX1、CCS、COX17、COX11、PAM、PRND、SNCA等多个铜代谢相关基因发生了突变，大部分突变无明确致病性，且某些突变发生在内含子上。笔者继续对非同义突变的SNP位点所在的基因，用topGO软件对目标基因进行GO富集分析。

1.3 GO和KEGG分析 GO分析显示虽然兄妹二人在致病基因ATP7B上的突变位点相同，但是在全基因组层面富集的SNP显示了二人在生物过程、分子功能、细胞组分上的差异。根据P值的大小，列出了前15个差异显著的条目，值得注意的是，先证者在基于Indel的GO分析，与铜离子结合的分子功能(GO:0005507)上，有明显差异，P值为0.014 56；而先证者妹妹前20个GO差异里则不包含这一项目(图2)。基因突变与临床表型之间有着复杂的基因调控机制，尚需要进一步研究。

注：a，先证者妹妹的基因突变富集的GO分子功能分析；b，先证者基因突变富集的GO分子功能。

2 讨论

人体每天从食物中吸收2～5 mg的铜离子，大部分在体内经过铜蓝蛋白转运至各个部位，多余的铜离子经胆汁排泄，通常情况下尿铜不超过50 μg/24 h。多个基因参与了铜离子的吸收和代谢。首先，细胞通过hCTR1吸收铜，一系列铜伴侣分子(ATOX1、CCS、COX17等)将铜离子运送至各个组织器官[3]。ATOX1与ATP7B相结合，调控ATP7B的N-末端活性[5]，同时其也可以调控ATP7B在细胞内的位置等[6]。ATP7B基因编码P型铜转运ATP酶，主要在肝脏中高表达，通过金属结合位点与铜离子结合，将铜离子从胞质转运至高尔基体，并将过量的铜从肝脏通过胆汁排泄。正常生理状态下，ATP7B蛋白在高尔基体反面网络中聚集，转运胞质中由ATOX1蛋白传递而来的铜离子，这些铜离子将用于血浆铜蓝蛋白的生物合成；当铜离子浓度增加到一定程度之后，ATP7B蛋白从高尔基体反面网络上解离，向肝细胞面的胆小管移动，通过胆汁将多余的铜排出体外[7]。若ATP7B基因突变，则导致铜离子外排通路障碍，铜离子超载，在细胞内蓄积。

肝豆状核变性作为ATP7B基因突变导致的单基因遗传病，其发病规律与基因突变位点关系密切，其发病年龄常在10～30岁[8]。不同位点突变对ATP7B功能的影响存在差异，并可能与不同的临床表现相关。ATP7B基因突变在亚洲人群中最常见的突变是p.Arg778Leu，欧美人群中为p.His1069Gln[9]。研究[10]发现，p.L492S、p.V519M、p.E541K、p.L549P、p.A604P、p.R616W、p.P992L、p.N1270S等突变往往预示着发病年龄较早，而具有p.I1148T突变的患者则大多在12岁后发病。本案例中兄妹二人均携带来自母源的p.P992L这一突变，先证者和其已故姐妹的发病年龄均为10～15岁，符合上述观点。先证者小妹同样携带这一突变，在33岁仍未发病。由图3可以看出，该2个位点突变的部位在ATP结合域之前，分别在第4和第6跨膜结构上，其中一个来自父亲的突变c.2304dupC为移码突变，可能会造成该蛋白的功能完全丧失，这可以用来解释先证者父亲尿铜升高。但不排除其他多种可能性导致这种情况发生，比如铜离子的摄入不足(限铜饮食)、排出增加、机体对铜离子的耐受程度等。

图3 ATP7B结构及患者突变所在位置

在相同的基因型的情况下，尽管起病症状可能不同，但是发病年龄常较为相近[11-13]。但是也有些许个例，兄弟姐妹的发病年龄差异很大。曾有文献[10]报道了一对姐弟，姐姐于72岁因亚急性肝衰竭和神经功能症状而被确诊，弟弟45岁开始出现轻微手部震颤，但因症状较轻而被忽略，在姐姐确诊后才诊断为肝豆状核变性，二人驱铜治疗后症状均有改善。之前也有过同一家庭内有孩子16岁发病后，其姐姐38岁发病的报道。笔者推测可能和等位基因的表达优势相关[14]。上述报道均为弟弟先发病，而姐姐迟发，存在性别差异。肝豆状核变性男女患病概率相同，但是症状仍然具有性别差异：男性更易出现神经症状；女性常首先出现肝损害，出现神经症状更晚[2]。这种现象可能与雌激素对神经的保护作用有关。

在本例家系中，相同基因型的兄妹间表现出了铜代谢指标及发病情况的极大差异。肝豆状核变性的临床表型受多种因素的影响[15]，ATP7B基因突变类型只是其中一部分。目前已研究的潜在影响因素包括修饰基因如ApoE[16]、MTHFR[17]、铜代谢MURR1结构域1[18]、氧化应激过程中的酶[19]、DNA甲基化以及饮食中的胆碱[20-21]、雌激素的保护作用等，均能影响肝豆状核变性的病情轻重。动物实验[19]表明，肝豆状核变性小鼠模型的低甲基化状态可由增加摄食中的胆碱含量而恢复至正常水平，同时肝脏病变有所改善。但在人类疾病过程中，甲基化对表型影响的程度尚无确切的报道。

肝豆状核变性不同临床表型与性别、饮食、修饰基因、甲基化调控等多种因素相关，期待未来有更多的研究加以关注，并为肝豆状核变性带来更多的治疗方式。

伦理学声明：本例报告已获得患者知情同意。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：胡亚欣、余蕾对研究的思路或设计有关键贡献；张宝芳、程卓、丛硕、刘咏梅、雷榆、蒲茜、严昭、张懿炜负责研究数据的获取分析；胡亚欣、程卓参与起草和修改文章关键内容；程明亮负责审核并最终定稿。