三七丹参片调节高脂血症小鼠脂质转运的机制

吴志焕，曹丹丹，刘利敏

(1.河北工程技术学院，河北 石家庄 050091；2.河北医科大学公卫学院，河北 石家庄 050017；3.惠州市中心人民医院生殖医学中心，广东 惠州 516000)

高脂血症是诱发心血管疾病的高危因素，尤其近来大型流行病学调查研究显示低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高与动脉硬化性心血管疾病的发生密切相关[1]，2018美国心脏协会与2019年欧洲动脉粥样硬化学会指南中均将控制LDL-C作为I级推荐证据。临床上多采用化学药物控制血脂，虽然具有较好的疗效，但是会对肝脏和肾脏造成损害，长期服用依从性差。天然来源的药物因其毒副作用较少而成为降脂研究领域的热点[2-3]。三七丹参片主要成分包括三七和丹参，是治疗心血管疾病中常用的中药口服片剂，在预防心血管疾病具有良好价值[4]。既往研究多认为三七丹参片主要作用为活血化瘀，理气止痛[5-6]，目前尚未有研究系统性阐述三七丹参片能否调节载脂蛋白及其生物学机制，本文从脂质转运、吸收水平探讨三七丹参片调节血脂的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 动物 40只SPF级C57BL/6小鼠，雌雄各半，体质量18～20 g，由河北中医学院提供，动物使用许可证号SYXK(冀)2017-005。

1.2 试剂与药物 三七丹参片(湖南守护神制药有限公司，批号20190117)。三磷酸腺苷结合盒转运体(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)兔单克隆抗体、ABCG1兔单克隆抗体，GAPDH鼠单克隆抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司；载脂蛋白A1(ApoA1)、ApoB均购自南京建成生物工程研究所；蛋白质裂解液购自美国Cell Signaling Technology公司；DNA反转录试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 仪器 CobasC501型全自动生化分析仪(瑞士罗氏公司)，QuantStudio 3型实时荧光定量PCR系统(美国赛默飞世尔公司)。

1.4 动物分组、造模与给药 将C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组及三七丹参片高、低剂量组，每组10只。正常组采用基础饲料进行饲养；模型组和三七丹参片组喂养高脂饲料，饲料组成为基础饲料52.2%、胆酸钠0.2%、预饲料0.4%、碳酸氢钙0.6%、胆固醇1.2%、猪油15%、蔗糖20%、酪蛋白10%、石粉0.4%。饲养期间可自由饮水，连续饲养6周后进行实验。实验开始后各组每日均给予普通饲料，自由饮水。给药组均灌胃给予相应药物，连续给药1周；三七丹参片高剂量组给药剂量为1.35 g/kg(约15倍临床成人剂量)，低剂量组给药剂量为0.45 g/kg(约5倍临床成人剂量)。

1.5 取材 小鼠最后1次给药后禁食12 h，可自由饮水。麻醉后眼眶取血，离心后取上清，于-80 ℃保存备用；取血完成后，开胸腔取出小鼠肝脏，擦干血迹后，一半采用4%甲醛固定进行检测分析，另一半于-80 ℃保存备用。

1.6 血脂水平和肝酶活性的检测 采用全自动生化分析仪对小鼠血清中血脂水平进行检测，包括低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)；采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中ApoA1及ApoB水平。

1.7 小鼠肝脏组织形态学评估 取各组小鼠石蜡包埋切片，制备HE染色后，显微镜下观察病理学改变。

1.8 RT-qPCR检测ABCA1、ABCG1 mRNA表达 取小鼠肝脏50 mg组织加入500 μL TRIzol后置于匀浆机低速离心90 s，离心完成后于冰上，加入350 μL氯仿混匀后于室温下静置15 min，随后低温12 000 r/min离心20 min，转移上清液至EP管中，加入异丙醇500 μL再次低温高速离心10 min，弃上清液后加入75%乙醇1 000 μL，低温8 000 r/min离心5 min，重复2次后，室温放至乙醇挥发净后加入30 μL DEPC水，升温至65 ℃溶解RNA，静置5 min后取上清。取2 μL总RNA，加入RNA模板、primer、dNTP混合液、双蒸水，20 μL反应体系下逆转录cDNA。使用LightCycler@480进行qPCR，ABCA1及ABCG1基因引物序列见表1，反应条件为95 ℃预变性15 s;随后95 ℃ 5 s，58 ℃30 s变性；72 ℃延申15 s；重复42个循环；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s溶解。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCT法计算相对表达度，ΔΔCT=(CT实验组目的基因-CT实验组GAPDH)-(CT对照组目的基因-CT对照组GAPDH)。

表1 引物序列

1.9 Western blot检测ABCA1、ABCG1蛋白表达 取50 mg小鼠肝脏，加入100 μL含有蛋白酶抑制剂的裂解液，匀浆机中低速匀浆1 min，随后匀浆液置于冰上继续裂解20 min，4 ℃下高速离心20 min，转移上清液至EP管中备用。使用SDS-PAGE凝胶电泳，10%脱脂奶粉常温封闭2 h后，加入兔抗ABCA1、ABCG1 (1∶1 000)和GAPDH(1∶4 000)置于冰箱中孵育24 h，室温恢复后使用PBST洗涤3次，每次5 min，加入二抗 (1∶2 000) 室温共孵育3 h，PBST洗涤，采用化学发光法显影，结果用Quantity one软件进行分析。

2 结果

2.1 三七丹参片对小鼠血脂水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清中LDL-C、TG、TC水平均升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)；与模型组比较，三七丹参片各剂量组小鼠血清中LDL-C、TG、TC水平均降低(P<0.05)，HDL-C水平均升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠血脂水平

2.2 三七丹参片对小鼠载脂蛋白水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清中ApoB水平升高(P<0.05)，ApoA1水平降低(P<0.05)；与模型组比较，三七丹参片各剂量组小鼠血清中ApoB水平均降低(P<0.05)，ApoA1水平均升高(P<0.05)，见表3。

表3 各组小鼠外周血载脂蛋白水平

2.3 三七丹参片对小鼠肝脏组织中ABCA1、ABCG1 mRNA表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏组织中ABCA1、ABCG1 mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较，三七丹参片各剂量组小鼠肝脏组织中ABCA1、ABCG1 mRNA表达升高(P<0.05)，见表4。

表4 各组小鼠肝脏组织中ABCA1、ABCG1 mRNA表达

2.4 三七丹参片对小鼠肝脏组织中ABCA1、ABCG1蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠ABCA1、ABCG1蛋白表达均降低(P<0.05)；与模型组比较，三七丹参片各剂量组ABCA1、ABCG1 蛋白表达均升高(P<0.05)，见表5、图1。

2.5 三七丹参片对小鼠肝脏组织病理形态的影响 正常组小鼠肝细胞结构完整，形态光滑，无脂肪堆积或侵蚀病变；模型组小鼠肝细胞堆叠不致密，包浆疏松化，可见空泡及炎症性细胞侵蚀；三七丹参片组可一定程度减少小鼠肝脏组织脂肪病变，且高剂量组保护效果优于低剂量组，见图2。

表5 各组小鼠肝脏组织中ABCA1、ABCG1蛋白表达

图1 各组小鼠肝脏组织中ABCA1、ABCG1蛋白电泳图

图2 各组小鼠肝脏病理形态(HE，×100)

3 讨论

高脂血症典型特点为脂质转运能力下降[7]，肝脏是体内脂质代谢的中枢，HDL-C负责将摄入脂质转移至肝内代谢分解为胆汁酸排出体外，而LDL-C参与肝内TC转运至肝外[8]。本研究显示，模型组小鼠血清中LDL-C、HDL-C的异常改变，造成TG、TC水平升高；在三七丹参片干预后，小鼠血脂水平有所改善，且呈现一定剂量依赖性，提示三七丹参片能够改善高脂血症小鼠的血脂水平，且机制可能与脂质转运、分布相关。

ApoA1作为HDL-C的载体蛋白，能够结合游离胆固醇增加其水溶性，从而促进转运至肝脏而代谢分解[9]，同时ApoA1能够激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的活性，正反馈调节促进TG运输至肝脏[10]。本研究显示，三七丹参片能够一定程度逆转高脂血症小鼠ApoA1水平下降趋势，结合血液HDL-C表达增加情况，推测三七丹参片降低TG、TC水平与调节ApoA1表达相关。同时三七丹参片组小鼠ApoB表达降低，而ApoB作为LDL-C的载体蛋白，能够促使血管平滑肌细胞增生，从而加速胆固醇在细胞内的脂化过程，诱导沉淀，上调LDL-C水平[11]。

胆固醇逆向转运初始限速步骤是游离胆固醇及磷脂与肝脏细胞内ApoA1结合[12]，而位于细胞膜上的ABCA1就是这一过程关键分子[13]，哺乳动物模型中ABCA1表达缺失或者功能障碍时，细胞内ApoA1因无法结合胆固醇而降解，从而导致血浆中HDL-C水平降低，胆固醇在血管壁沉积[14]。本研究中，模型组小鼠ABCA1 mRNA及蛋白表达均降低，这也解释了血清中HDL-C水平下降的原因；而在三七丹参片组中，ABCA1表达增加，增加ApoA1与胆固醇结合，一方面抑制肝内ApoA1降解，另一方面达到降低血脂的效果。

ABCG1作为维持细胞内胆固醇和磷脂稳态的重要膜蛋白，促进HDL-2、HDL-3及HDL与载脂蛋白结合，同时与ABCA1协同作用，避免肝细胞内胆固醇过量堆积而造成肝损伤[15]。本研究小鼠肝脏组织形态学结果显示，高脂血症小鼠肝脏呈明显脂肪样病变，细胞浆气球状松化；而三七丹参片组小鼠肝脏病变程度较轻，这可能与ABCG1蛋白的保护功能相关，提示三七丹参片可能通过血脂转运途径，对肝脏细胞起到保护作用。